酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，又称为生物催化剂。生物体内的所有化学反应，几乎都是在酶的催化下进行的，因此酶学的研究，对于了解生命活动的规律、阐明生命现象的本质以及指导相关的医学实践、工业生产都有重要的意义。
蔗糖酶（sucrase，EC 3.2.1.26）又称为转化酶（invertase）。蔗糖在蔗糖酶的作用下水解为D—葡萄糖和D—果糖。按照水解蔗糖的方式蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的呋喃果糖苷酶和从葡萄糖末端切开蔗糖的葡萄糖苷酶。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。通常所讲的蔗糖酶是指分解蔗糖中果糖糖苷键的酶。
蔗糖酶主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌、植物中，但工业上通常从酵母中制取。这是古老的酶制剂之一，很久以前就用来作为酶化学的研究材料，很多有关酶的基础知识都是通过蔗糖酶的研究取得的。
酵母蔗糖酶是胞内酶，提取时需破碎细胞。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、离子交换和凝胶柱层析等。可得到较高纯度的酶，但高纯度的酶大多很不稳定，大多商品酶为粗酶溶解于甘油的液状制品。也可将蔗糖酶同单宁酸相结合得到极稳定的固定化酶。
蔗糖酶在食品工业中，用以转化蔗糖增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，还可用来制造果糖和巧克力的软糖心等。
内容一 酵母蔗糖酶的提取及分离纯化
一、实验目的
（1）学习并掌握蛋白质和酶的基本研究过程。
（2）掌握生物大分子的提取、分离纯化的方法。
（3）掌握有机溶剂分级沉淀。
二、实验原理
1.细胞破壁
蔗糖酶是胞内酶，必须破坏细胞，将其从细胞内释放出来。细胞破壁方法如下所述。
（1）高速组织捣碎 将材料配成稀糊状，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，再开动开关，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质、种子等。
（2）玻璃匀浆器匀浆 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杵来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量的动物脏器组织。
（3）超声波处理法 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧振荡破裂，此法多适用于微生物材料，常选用50～100mg菌体/mL浓度，在30～60Hz频率下处理10～15min，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应的降温措施。对超声波敏感的核酸应慎用。
（4）反复冻融法 将细胞在-20℃以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒的形成和剩余细胞液的盐浓度增加引起溶胀，使细胞结构破碎。
（5）化学处理法 有些动物细胞，如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等将细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。
2.有机溶剂分级沉淀
利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度的差异分离酶蛋白的方法称作有机溶剂分级沉淀法。有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的下降；有机溶剂与水作用，还能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中可沉淀析出。操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度以减少其变性，提高分离效果。与盐析法相比，该法的分辨率高，但易使酶变性失活。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
2.仪器
3.试剂
（2）起始缓冲液5mmol/L磷酸钠缓冲液（pH 6.0）。
四、实验步骤
蔗糖酶的分离提纯。
（1）蔗糖酶粗品的制备 细胞破碎：采用细胞自溶法，取20g高活性干酵母粉倒入烧杯中，少量多次加入50mL去离子水，搅拌成糊状后，加入2g乙酸钠、30mL乙酸乙酯，搅匀。再于35℃温水浴中搅拌30min，补加去离子水30mL，搅匀。用硫酸纸封严，于35℃恒温过夜。4℃下8000r/min离心10min，取上清液，得到无细胞抽提液（自溶破壁的酶液位于中层），量出粗酶液的体积V1，粗酶液保存于4℃冰箱，待测蛋白质浓度和蔗糖酶活力。
（2）乙醇分级 将1/2粗酶液用稀乙酸调pH至4.5，其余1/2粗酶液冷冻保存用于蛋白质浓度和蔗糖酶活力测定等。
第一次乙醇沉淀（乙醇终浓度为32%）：计算出使粗酶液的乙醇浓度达32%时所需95%乙醇的体积；把粗酶液和量好的乙醇在冰水浴中预冷，缓慢滴加乙醇并不断搅拌。滴加结束后，4℃，8000r/min离心5min，留取上清液。
第二次乙醇沉淀（乙醇终浓度为47.5%）：计算出使粗酶液中乙醇浓度达47.5%时所需补加95%乙醇的体积；按上述方法加入乙醇后于4℃，8000r/min离心10min，沉淀立刻用10～15mL起始缓冲液溶解并对该溶液透析过夜。次日，离心（4℃，8000r/min，5min）得酶液，量出体积V2，取出适量酶液保存于4℃冰箱，待测蛋白质浓度和蔗糖酶活力。
五、结果与讨论
记录实验结果，并加以解释，若有异常现象，可进行分析讨论。
六、注意事项
离心前一定要平衡，并对称放入，盖好盖子。
思考题
1.简述蔗糖酶分离提取的原理及操作步骤。
2.简述蔗糖酶活力测定的原理及两个反应。
3.在酶分离提纯的整个过程中应注意的一个关键问题是什么？
内容二 蔗糖酶活力的测定
一、实验目的
（1）学习3，5—二硝基水杨酸（DNS试剂）比色定糖的原理和方法。
（2）掌握酶的比活力测定及其计算方法。
（3）掌握分光光度计的使用方法。(www.xing528.com)
二、实验原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中，乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其他产物，3，5—二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3—氨基-5—硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定吸光度，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。比活力是以每毫克酶蛋白含有的活力单位数表示。规定：在pH 4.6，35℃，每分钟能使5%蔗糖溶液水解释放1mg还原糖的酶量定为一个活力单位。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
酵母蔗糖酶。
2.仪器
烧杯、搅拌棒、滴管、量筒、移液管、容量瓶、试管、血糖管（或刻度试管）、秒表、恒温水浴槽、电子天平、722型分光光度计。
3.试剂
（1）3，5—二硝基水杨酸试剂。
（2）1mol/L氢氧化钠溶液。
（3）5%蔗糖溶液。
（4）1mg/mL葡萄糖标准液。
（5）pH 4.6，0.2mol/L乙酸缓冲液。
四、实验步骤
（1）标准曲线的制作 取7支试管编号，按表1-8的顺序加入各种试剂。
表1-8 标准曲线的制作
摇匀后，用空白管（0号）调零，在540nm处测定吸光度，以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A540值为纵坐标，做出标准曲线。
（2）蔗糖酶活力的测定 取两支试管分别加入用pH 4.6、0.2mol/L乙酸缓冲液适当稀释过的酶液2mL，一支中加入0.5mL 1mol/L氢氧化钠，摇匀，使酶失活（作对照），另一支作测定管：把两支试管和5%蔗糖溶液放入35℃水浴中恒温预热；分别取2mL 5%蔗糖加入上述两试管中，并准确计算时间，3min后于测定管中加入0.5mL 1mol/L氢氧化钠，摇匀，使酶失活。
从反应混合物中取出0.5mL溶液放入血糖管中，加入1.5mL 3，5—二硝基水杨酸试剂和1.5mL水，摇匀。于沸水浴中准确反应5min，立即用冷水冷却，加水稀释至25mL，摇匀，于540nm处测定吸光度。
乙醇沉淀前的粗酶液也需要测定酶活力，步骤同上。
五、结果与讨论
在葡萄糖标准曲线上找到所测定光密度值对应的葡萄糖含量，按式（1-3）计算酶活力。
数据处理方法：
其中 总活力=蔗糖酶活力×V
比活力=总活力/蛋白质总量
回收率=（每一步总活力/第一步总活力）×100%
纯化倍数=每一步比活力/第一步比活力
式中 m——测定管葡萄糖质量，mg；
n——稀释倍数；
V——酶液体积，mL
t——反应时间，min。
六、注意事项
（1）工作曲线的使用 不许延长，因为比耳定律只适用于稀溶液中的反应。
（2）测定酶活力时的显色反应
①等沸水浴锅中的水沸腾后再放入试管；
② 用秒表计时，取出后立即用冷水冷却，加蒸馏水定容至25mL，摇匀，测定540nm处的吸光度。
（3）酶是有生物活性的蛋白质，在整个实验过程中都要注意防止酶失活。
思考题
1.写出3，5—二硝基水杨酸的化学结构式。
2.分光光度计比色测定的基本原理是什么？操作要点是什么？
3.比色测定时为什么要设计空白管？
4.总糖包括哪些化合物？
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
