内容一 蛋白质等电点测定
一、实验目的
了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
二、实验原理
蛋白质的分子质量很大，它能形成稳定均一的溶液，主要是由于蛋白质分子都带有相同符号的电荷，同时蛋白质分子周围有一层溶剂化的水膜，避免蛋白质分子之间聚集而沉降。
蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中成阳离子，在碱性溶液中成阴离子（图1-2）。
图1-2 溶液中蛋白质分子在不同pH时的带电情况及在电场中的行为
蛋白质分子所带净电荷为零时的pH称为蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，这时蛋白质溶液的黏度、渗透压均降到最低，且溶液变混浊。若再加入一定量的溶剂如乙醇、丙酮，与蛋白质分子争夺水分子，降低蛋白质水化层的厚度而使混浊更加明显。
各种蛋白质的等电点都不相同，偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的pI为4.7～4.8，血红蛋白的pI为6.7～6.8，胰岛素pI为5.3～5.4，鱼精蛋白是一种碱性蛋白质，其等电点为12.0～12.4。蛋白质的pI可以用等电聚焦电泳准确测定。本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的pH即为该种蛋白质的等电点，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作简便。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
试管：ϕ1.5cm 9支；吸管：1、2、10mL各2支；容量瓶：50mL 2个、500mL 1个。
2.仪器
水浴锅、温度计。
3.试剂
（1）0.4%酪蛋白醋酸钠溶液 称取酪蛋白2g，放在烧杯中，加入40℃的蒸馏水。加入50mL 1.00mol/L氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。将溶解好的蛋白质溶液转移到500mL容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。在容量瓶中再加入100mol/L醋酸溶液50mL，摇匀。加入蒸馏水定容至500mL，得0.1mol/L酪蛋白醋酸钠溶液。
（2）0.01mol/L醋酸溶液50mL。
（3）0.10mol/L醋酸溶液100mL。
（4）1.00mol/L醋酸溶液100mL。
（5）1.00mol/L氢氧化钠溶液50mL。
四、实验步骤
取同样规格的试管4支，按表1-1顺序准确地加入各试剂，加入后立即摇匀。观察各管产生的混浊并根据混浊度来判断酪蛋白的等电点，最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。观察时可用+、++、+++表示混浊度。
表1-1 酪蛋白等电点测定
五、结果与讨论
酪蛋白的等电点为多少？为什么？
六、注意事项
4支试管加入试剂时需要准确。
思考题
1.在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。
2.本实验中，酪蛋白在等电点时从溶液中沉淀析出，所以说凡是蛋白质在等电点时必然沉淀出来。这种结论对吗？为什么？
3.在分离蛋白质时等电点有何实际应用意义？
[1]王秀奇，秦淑媛，高天慧，等．基础生物化学实验[M].2版．北京：高等教育出版社，1999.
[2]李可群．利用对分法求取蛋白质等电点[J].思茅师范高等专科学校学报，2009，25（3）：41-42.
[3]李可群．一种蛋白质等电点的简便计算方法[J].曲靖师范学院学报，2009，28（3）：25-28.
内容二 蛋白质的沉淀反应
一、实验目的
加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识，了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义，了解蛋白质变性与沉淀的关系。
二、实验原理
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
1.可逆的沉淀反应
此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并可保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。
2.不可逆沉淀反应
此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此，变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
试管：ϕ1.5cm 9支；吸管：1、2、10mL各2支；容量瓶：100、500mL各1个；胶头滴管2支；量筒：100、500mL各1个。
2.仪器
水浴锅、温度计、天平、试管架。
3.试剂
（1）蛋白质溶液500mL 5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清∶水=1∶9）。
（2）pH 4.7醋酸—醋酸钠的缓冲溶液100mL。
（3）3%硝酸银溶液10mL。
（4）5%三氯乙酸溶液50mL。
（5）95%乙醇250mL。
（6）饱和硫酸铵溶液250mL。
（7）硫酸铵结晶粉末500g。
（8）0.1mol/L盐酸溶液300mL。
（9）0.1mol/L氢氧化钠溶液100mL。
（10）0.05mol/L碳酸钠溶液100mL。
（11）0.1mol/L醋酸溶液100mL。
（12）甲基红溶液20mL。
（13）2%氯化钠溶液150mL。
（14）2%醋酸50mL。
（15）20%磺基水杨酸溶液50mL。
四、实验步骤
（1）蛋白质的盐析 无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，沉淀又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。
加5%卵清蛋白溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察沉淀是否溶解，为什么？将管中内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。
取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。
（2）重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。
取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加3%硝酸银溶液1～2滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，观察沉淀是否溶解，为什么？
（3）某些有机酸沉淀蛋白质 取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加1mL 5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。
（4）有机溶剂沉淀蛋白质 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL 95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。
（5）乙醇引起的变性与沉淀 取3支试管，编号。按表1-2顺序加入试剂。
表1-2 乙醇引起的变性与沉淀
振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水8mL，然后在三支管中各加一滴甲基红，再分别用0.1mol/L醋酸溶液及0.05mol/L碳酸钠溶液中和2、3号两支试管。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1mol/L盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。
（6）尿蛋白的定性检验 正常人尿中只含有微量蛋白质，不能用常规方法测定出来。用临床常规方法能检查出蛋白质的尿称为蛋白尿。患肾脏疾病的人（如患肾小球肾炎、肾盂肾炎）往往有蛋白尿，因此，尿中蛋白质的检查在临床上具有重要的诊断意义。
①加热醋酸法：尿中的蛋白质加热变性后溶解度降低，因此可以被沉淀出来，加入醋酸使尿液呈弱酸性后，蛋白质仍不易溶解，但因加热引起的磷酸盐混浊则在加入醋酸后消失，故二者可以区别。
取尿液3mL置于试管中，加热至沸腾（应在火焰上移动试管，严防尿液喷出）。观察有无沉淀产生。若产生沉淀，则加入2%醋酸数滴使溶液显酸性，然后观察沉淀情况。按表1-3记录结果。
表1-3 加热醋酸法结果与尿中蛋白质的浓度的关系
②磺基水杨酸法：利用有机酸沉淀蛋白质，是临床常用的方法。此法较“加热醋酸法”更为灵敏，尿中蛋白质浓度为0.0015%即可检出。
a.取尿约3mL加入试管中。
b.加入20%磺基水杨酸8～10滴，如出现沉淀，表示尿中有蛋白质存在。参考表1-3，按沉淀多少记录结果。
五、结果与讨论
记录实验结果，解释各部分实验发生的全部现象。
六、注意事项
乙醇引起的变性与沉淀部分：用0.1mol/L醋酸溶液中和2号试管及0.05mol/L碳酸钠溶液中和3号试管，观察各管颜色的变化和沉淀的生成。重点是观察沉淀的生成，颜色的变化用于判断pH。
思考题(www.xing528.com)
1.如何从低分子质量的胺类化合物（非蛋白质的化合物）分离出蛋白质？
2.鸡蛋清为何可作铅、汞中毒的解毒剂？
3.氯化汞为何能作杀菌剂？
4.沉淀、变性之间有什么样的关系？哪些沉淀往往伴随变性？
5.有机酸（如三氯乙酸）沉淀蛋白质有无实际应用意义？
6.有机溶剂是否一定引起蛋白质发生变性？
参考文献
王秀奇，秦淑媛，高天慧，等．基础生物化学实验[M].2版．北京：高等教育出版社，1999 .
内容三 蛋白质的呈色反应
一、实验目的
（1）了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。
（2）了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
（3）学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
二、实验原理
1.双缩脲反应
双缩脲反应过程如图1-3所示。
图1-3 双缩脲反应
尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出1分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应，蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。
双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有1个肽键和1个—CS—NH2、—CH2—NH2、—CRH—NH2、—CH2—NH2—CH2—NH2—CH2OH或—CHOHCH2NH2等基团的物质以及含有乙二酰二胺等物质也有此反应。NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
2.茚三酮反应
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
β—丙氨酸、氨和许多一级胺都对茚三酮呈正反应。尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。
该反应十分灵敏，1∶1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成二氧化碳、氨气和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。
此反应的适宜pH为5～7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
3.黄色反应
黄色反应过程如图1-4所示。
图1-4 黄色反应
含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
三、实验材料、仪器与试剂
（一）双缩脲反应
1.材料
牛乳。
2.仪器
吸头、试管。
3.试剂
（1）尿素。
（2）10%氢氧化钠溶液1000mL。
（3）1%硫酸铜溶液500mL。
（4）2%卵清蛋白溶液（可用牛乳代替）。
（二）茚三酮反应
1.材料
新鲜鸡蛋（牛乳）、甘氨酸。
2.仪器
试管、吸头、滤纸。
3.试剂
（1）蛋白质溶液2%卵清蛋白或鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）（牛乳）。
（2）0.5%甘氨酸溶液500mL。
（3）0.1%茚三酮水溶液500mL。
（4）0.1%茚三酮乙醇溶液500mL。
（三）黄色反应
1.材料
2.仪器
纱布、研钵、试管、吸头。
3.试剂
（1）鸡蛋清溶液（牛乳）100mL将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1∶20混匀，然后用6层纱布过滤。
（2）大豆提取液1000mL将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤。
（3）0.5%苯酚溶液100mL。
（4）浓硝酸200mL。
（5）0.3%色氨酸溶液100mL。
（6）0.3%酪氨酸溶液100mL。
（7）10%氢氧化钠溶液200mL。
四、实验步骤
1.双缩脲反应
取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷却后，加10%氢氧化钠溶液约1mL，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
向另一试管加牛乳约1mL和10%氢氧化钠溶液约2mL，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。
2.茚三酮反应
（1）取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1mL，再各加0.5mL 0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1～2min，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。
（2）在一小块滤纸上滴1滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴1滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
3.黄色反应
向7支试管中分别按表1-4加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。
表1-4不同材料的黄色反应
五、结果与讨论
（1）双缩脲反应 双缩脲反应结果可填入表1-5。
表1-5 双缩脲反应结果
（2）茚三酮反应 茚三酮反应结果可填入表1-6。
表1-6 茚三酮反应结果
（3）黄色反应 黄色反应结果可填入表1-7。
表1-7 黄色反应结果
六、注意事项
（1）茚三酮反应必须在pH为5～7进行。
（2）操作请按步骤进行。
思考题
通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法？它们的原理分别是什么？
参考文献
[1]王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学[M].北京：高等教育出版社，2002.
[2]李巧枝，程绎南．生物化学实验技术[M].北京：中国轻工业出版社，2010.
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