提取酪蛋白的实验方法及步骤

一、实验目的

学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法，加深对等电点概念的理解。

二、实验原理

牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是以酪蛋白酸钙—磷酸钙复合体胶粒存在，胶粒直径为20～800nm，平均为100nm。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。本实验利用加酸，当达到酪蛋白的等电点pI=4.7时，酪蛋白沉淀。用乙醇、乙醇—乙醚混合物、乙醚来洗涤沉淀物，以去除醇溶性和脂溶性杂质，就可得到较纯的酪蛋白。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

牛乳。

2.仪器

离心机、恒温水浴锅、抽滤装置、烧杯、温度计、精密试纸pH 4.7、玻璃棒、三角瓶、量筒。

3.试剂

（1）95%乙醇1200mL。

（2）无水乙醚1200mL。

（3）乙醇—乙醚混合液=1∶1（体积分数）2000mL。

（4）2mol/L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲溶液3000mL。

先配置A液与B液。

A液（0.2mol/L醋酸钠溶液）：称取NaAc·3H₂O 54.44g，定容至2000mL。

B液（0.2mol/L醋酸溶液）：称取优级纯醋酸（含量＞99.8%）12.0g，定容至1000mL。

取A液1770mL，B液1230mL，混合即得p H4.7的醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL。

四、实验步骤

（1）将40mL牛乳加热至40℃，边搅拌边向烧杯中慢慢加入预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液40mL，用精密试纸或酸度计调pH至4.7。

（2）将上述悬浮液冷至室温。3000r/min离心15min，沉淀为酪蛋白粗制品。(www.xing528.com)

（3）用水洗沉淀3次，每次洗后3000r/min离心10min，弃去清液。

（4）在沉淀中加入约10mL乙醇，搅拌，将悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。

（5）将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品。

五、结果与讨论

准确称重，计算含量和得率，如式（1-1）、式（1-2）所示。

式中 m——酪蛋白质量，g；

V——牛乳体积，mL。

式中，理论含量为3.5g/100mL牛乳。

六、注意事项

（1）离心管装入样品后必须严格配平，否则对离心机损坏严重。

（2）离心管装入样品后必须盖严，擦干表面的水分和污物后方可放入离心机。

（3）离心机用完后应拔下电源，然后检查离心腔中有无水迹和污物，擦除干净后才能盖上盖子放好保存，以免生锈和损坏。

思考题

1.为什么调整溶液的pH可以将酪蛋白沉淀出来？

2.制备高得率纯酪蛋白的关键是什么？

3.试设计一个利用蛋白质其他性质提取蛋白质的实验。

参考文献

[1]王秀奇，秦淑媛，高天慧，等．基础生物化学实验[M]. 2版．北京：高等教育出版社，1999.

[2]陈钧辉，袁道强，陈世锋．生物化学实验[M].2版．北京：科学出版社，2003.