蛋白质结构的四个层级及其功能

蛋白质的结构包括4个水平，即一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。

（一）一级结构

蛋白质的构成单元氨基酸通过酰胺键（肽键）共价连接而形成的线性序列被称为蛋白质的一级结构（Primary structure）。一个氨基酸的α-羧基与相邻氨基酸的α-氨基缩合失去一分子水形成肽键。在线性序列中所有的氨基酸残基都是L-型。由n个氨基酸残基构成的蛋白质分子含有（n-1）个肽键。游离的α-氨基末端被称为N-末端，而游离的α-羧基末端被称为C-末端。根据惯例，可用N表示多肽链的开始端，C表示多肽链的末端。

由n个氨基酸残基连接而形成的链长（n）和序列决定着蛋白质的物理化学性质、结构和生物性质及功能。蛋白质的氨基酸序列决定其二级结构和三级结构，最终决定着蛋白质的生物功能。蛋白质的分子质量有的为几千道尔顿（u），有的高达上百万。例如，存在于肌肉中的单肽链蛋白质-肌联蛋白（titin）的分子质量超过10³ku，而肠促胰液肽（Secretin）的分子质量仅为2300u。大多数蛋白质的分子质量在20k～100ku。

多肽链的主链可用重复的—N—C_α—C或—C_α—C—N—单位表示。—N—C_α—C—（即—NH—C_αHR—CO—）是指一个氨基酸残基，而—C_α—C—N—（即—C_αHR—CO—NH—）是指一个肽单位。虽然CO—NH键被描述为一个共价单键，实际上，由于电子非定域作用而导致的共振结构使它具有部分双键的特征。肽键的这个特征对于蛋白质的结构具有重要的影响。

多肽主链基本上可被描述为通过C_α原子连接的一系列—C_α—CO—NH—C_α—平面（图5-2）。由于主链中肽键约占共价键总数的1/3，而肽键不能自由旋转，从而显著地降低了主链的柔性。仅N—C_α和C_α—C键具有转动自由度，它们分别被定义为ϕ两面角和ψ两面角，也称为主链扭转角。虽然N—C_α和C_α—C键是单键，ϕ和ψ理论上具有360°转动自由度，实际上它们的转动自由度由于C_α原子上侧链原子的立体位阻而被限制，这些限制进一步减小了多肽链的柔性。

肽键的部分双键性质使得键上的4个原子能以顺式或反式构型存在。然而，几乎所有的蛋白质肽键都是以反式构型存在的，这是因为在热力学上反式构型比顺式构型稳定。

图5-2 多肽主链的肽单位的原子的平面构型

ϕ和ψ是C_α—N和C_α—C键的两面（扭转）角，侧链位于平面的上方和下方

（二）二级结构

蛋白质的二级结构（Secondary structure）是指在多肽链某些部分的氨基酸残基周期性的（有规则的）空间排列，即沿着肽链轴所采取的特有的空间结构。在多肽链的某个部分，连续的氨基酸残基采取同一组ϕ和ψ时就形成了周期性的结构。氨基酸残基侧链之间近邻或短距离的非共价相互作用决定着ϕ和ψ角的扭转并导致局部自由能的下降。在多肽链的某些区域，连续的氨基酸残基具有不同组的ϕ和ψ就形成了非周期性或随机结构。

一般来说，在蛋白质分子中存在着两种周期性的（有规则的）二级结构，它们是螺旋结构和伸展片状结构。

1.螺旋结构

当连续的氨基酸残基的ϕ和ψ角按同一组值扭转时，形成了蛋白质的螺旋结构。通过选择不同的ϕ和ψ组合，理论上有可能产生几种几何形状的螺旋结构。然而，在蛋白质分子中仅存在α-螺旋、3₁₀-螺旋和π-螺旋这3种螺旋结构，其中α-螺旋是蛋白质中主要的螺旋结构形式。

α-螺旋的结构特点如下：

（1）主链绕中心轴按螺旋方向盘旋，每3.6个氨基酸残基前进一圈，螺距即每圈所占的轴长为0.54nm，每一个氨基酸残基占轴长0.15nm（图5-3）。α-螺旋能以右手或左手螺旋两种方式存在，而右手螺旋更加稳定。在天然的蛋白质中仅存在右手α-螺旋（ϕ和ψ分别为-58°和-47°）。

图5-3α-螺旋结构（右手）

R代表氨基酸残基的侧链

（2）α-螺旋是依靠氢键而稳定的。主链上每一个氨基酸残基的N—H与它前面第四个氨基酸残基的C=O形成氢键，氢键平行于螺旋轴而定向。在此氢键圈中包含13个主链原子，于是α-螺旋也被称为3.6₁₃螺旋。氢键的N、H和O原子几乎处在一条直线上。氢键的长度，即N—H…O距离约为0.29nm，而键的强度约为18.8kJ/mol。

（3）氨基酸残基的侧链按垂直于螺旋的轴的方向定向排列，分布在螺旋的外侧。其形状、大小及电荷等均影响α-螺旋的形成和稳定性。

在脯氨酸残基中，由于丙基侧链通过共价键与氨基形成了环状结构，使得N—C_α键不能旋转，而ϕ具有一个固定值70°。并且由于在N原子上不存在H，因此不能形成氢键。由于脯氨酸残基的上述两个特性，蛋白质分子中含有脯氨酸残基的部分不能形成α-螺旋。事实上，可将脯氨酸残基看作为α-螺旋的终止物。脯氨酸残基含量高的蛋白质倾向于采取随机或非周期性的结构。例如，在β-酪蛋白和α_s1-酪蛋白中脯氨酸残基分别占总氨基酸残基数的17%和8.5%，而且它们均匀地分布在整个蛋白质分子的一级结构中，因此，在这两种蛋白质分子中不存在α-螺旋结构。

然而，聚脯氨酸也能形成两种类型的螺旋结构，聚脯氨酸Ⅰ和聚脯氨酸Ⅱ。聚脯氨酸I是左手螺旋，每圈3.3个氨基酸残基，肽键是顺式构型；聚脯氨酸Ⅱ也是左手螺旋，每圈3个氨基酸残基，肽键是反式构型，两个氨基酸残基在轴上投影之间的距离为0.31nm。这两种结构有可能相互转变，聚脯氨酸Ⅱ在水溶液中更为稳定。这样的螺旋结构存在于胶原蛋白质。胶原蛋白是结缔组织蛋白质，在脊椎动物的皮、腱、骨和角膜等中含量很丰富。

此外，某些氨基酸由于它们的侧链的静电性质或立体结构，使得多肽链不可能形成螺旋结构。当出现这种情况时，多肽链的结构具有以下的特征：带有相同电荷的基团之间的距离是最大的，而推斥的自由能是最低的。这种结构是随机螺旋。

2.β-折叠片结构

β-折叠片结构是一种具有特定的几何形状的伸展结构（图5-4），它是蛋白质中第二种最常见的二级结构。其构象特征如下：

（1）肽链的伸展使肽键平面之间一般折叠成锯齿状。不同多肽链或一条多肽链的不同肽段平行排列，相邻主链骨架之间依靠氢键来维系。

（2）肽链中氨基酸残基的侧链R按垂直于片状结构的平面（在平面上和平面下）定向。

（3）根据多肽主链中N→C的指向，存在着两类β-折叠片结构，即平行β-折叠片结构（各股指向相同，即N端在同侧）和反平行β-折叠片结构（各股指向相反，即N端不在同侧）。β-折叠片结构中链的指向影响着氢键的几何形状。在反平行β-折叠片结构中，N—H…O的原子处在一条直线上（氢键角为0），增加了氢键的稳定性。于是，反平行β-折叠片结构比平行β-折叠片结构更为稳定。

图5-4 β-折叠片结构

P—平行β-折叠片（A链和B链之间）

AP—反平行β-折叠片结构（B链和C链之间）

β-折叠片结构通常比α-螺旋结构更为稳定。含有高比例的β-折叠片结构的蛋白质一般呈现高变性温度。以β-乳球蛋白（51%β-折叠片结构）和大豆11S球蛋白（64%β-折叠片结构）为例，它们的热变性温度分别为75.6℃和84.5℃。然而，牛血清蛋白（64%α-螺旋结构）的变性温度仅为64℃。α-螺旋结构类型的蛋白质溶液经加热再冷却时，α-螺旋结构通常转变成β-折叠片结构。然而，从β-折叠片结构转变成α-螺旋结构的现象在蛋白质中尚未发现。

3.β-旋转

β-旋转（β-turn）是蛋白质中常见的另一种结构。β-折叠片结构中的多肽链反转180°就形成β-旋转（见图5-5）。一个β-旋转结构通常包括4个氨基酸残基，第一个氨基酸残基的羰基与第四个氨基酸残基的亚氨基之间形成氢键以维持其构象。在β-旋转结构中常见的氨基酸残基有Asp、Cys、Asn、Gly、Tyr和Pro。

图5-5 β-旋转的构象

Ⅰ型（1）和Ⅱ型（2）

表5-6所示为一些蛋白质分子的二级结构。

表5-6 一些蛋白质分子的二级结构

注：数值代表占总的氨基酸残基的百分数。

（三）三级结构

蛋白质的多肽链在二级结构的基础上进一步盘曲或折叠形成的三维空间结构，称为蛋白质的三级结构。蛋白质的三级结构涉及多肽链的空间排列。图5-6所示为β-乳球蛋白的三级结构。

蛋白质从线性结构变成折叠状三级结构是一个复杂的过程。在分子水平上，蛋白质的结构取决于其氨基酸序列。从能学角度考虑，三级结构的形成包括各种不同基团之间的相互作用（疏水相互作用、静电相互作用和范德华力）和氢键的优化，使得蛋白质分子的自由能尽可能地降到最低。在三级结构形成的过程中，疏水性氨基酸残基大多包埋在蛋白质结构的内部，而亲水性氨基酸残基尤其是带电荷的氨基酸残基大多分布在蛋白质-水界面，同时伴随着自由能的降低。(www.xing528.com)

一级结构中亲水性和疏水性氨基酸残基的比例和分布影响着蛋白质的某些物理化学性质。例如，氨基酸顺序决定着蛋白质分子的形状。如果一种蛋白质含有大量的亲水性氨基酸残基并且均匀地分布在氨基酸序列中，那么蛋白质分子将呈拉长或棒状；反之，如果一种蛋白质含有大量疏水性氨基酸残基，那么蛋白质分子将呈球状。于是，表面积与体积之比能降到最低，同时使更多的疏水性氨基酸残基能埋藏在蛋白质分子的内部。

图5-6β-乳球蛋白的三级结构

箭代表β-折叠片结构，共有9股，图中也指出了一个短的α-螺旋结构（从氨基酸残基131～140）

（四）四级结构

四级结构是指由两条或两条以上的多肽链聚合而成的蛋白质分子的空间构象。其中，每条多肽链称为一个亚基（Subunit）。由两个或两个以上亚基组成的蛋白质称为寡聚蛋白质。寡聚蛋白质的这些亚基可以是相同的或者是不同的。例如，血红蛋白是由两个α-亚基和两个β-亚基构成的四聚体。

四级结构实际上是指亚基的立体排布、相互作用及接触部位的布局。亚基之间主要是非共价相互作用，包括氢键、疏水相互作用和静电相互作用等。疏水性氨基酸残基所占的比例似乎影响着寡聚体结构形成的倾向。蛋白质分子中疏水性氨基酸残基含量高于30%时，它形成寡聚体的倾向大于那些含有较少疏水性氨基酸残基的蛋白质。

从热力学角度考虑，需要将亚基暴露的疏水性表面埋藏起来，这就驱动着蛋白质分子四级结构的形成。当一个蛋白质分子中疏水性氨基酸残基含量高于30%时，它在物理上已不可能形成一种能将所有的非极性残基埋藏在内部的三级结构。因此，在表面存在疏水性小区的可能性就很大，在相邻单体的小区之间的相互作用能导致形成二聚体、三聚体等（图5-7）。

图5-7 蛋白质中二聚体和寡聚体的形成

许多食品蛋白质，尤其是谷类蛋白，是以不同的多肽链构成的寡聚体形式存在（表5-7）。可以预料这些蛋白质含有高于35%的疏水性氨基酸残基（IIe、Leu、Trp、Tyr、Val、Phe和Pro）。此外它们还含有6%～12%的脯氨酸。因此，谷类蛋白多以复杂的寡聚体结构存在。大豆中主要的储藏蛋白质，即β-大豆伴球蛋白（7S）和大豆球蛋白（11S），分别含有约41%和39%疏水性氨基酸残基。β-大豆伴球蛋白是由三种不同的亚基所构成的三聚体，随着离子强度和pH的变化呈现复杂的缔合-解离现象。组成大豆球蛋白的五种亚基分别为A_1bB₂、A₂B_1a、A_1aB_1b、A₃B₄和A₅A₄B₃，其中每种亚基均由酸性肽链（A）和碱性肽链（B）通过二硫键连接而成。6个酸性-碱性亚基对通过非共价相互作用结合成寡聚体状态。大豆球蛋白随离子强度的变化也呈现复杂的缔合-解离性质。

表5-7 某些寡聚体食品蛋白质

从热力学角度来看，蛋白质的天然构象是各种有利于稳定的相互作用达到最大而各种不利于稳定的相互作用降到最小，于是整个蛋白质分子的自由能尽可能地降至最低时的一种状态。蛋白质稳定性是使蛋白质分子能达到和保持天然构象的一种状态，然而并不排除生理功能所必需的构象调整。

影响蛋白质结构的分子内作用力包括两类：①蛋白质分子固有的作用力所形成的分子内相互作用；②受周围溶剂影响的分子内相互作用。范德华相互作用（Van der Waals interaction）和空间相互作用（Steric interaction）属于前者，而氢键、静电相互作用和疏水相互作用力属于后者。

1.空间相互作用

理论上，ϕ和ψ角具有360°的转动自由度，实际上由于氨基酸残基侧链原子的空间位阻而使它们的转动受到很大的限制。因此，多肽链的一个部分仅能采取数目有限的构象。肽单位平面几何形状的扭曲或者键的伸展和弯曲会导致分子自由能的增加。因此，多肽链的折叠必须避免键长和键角的变形。

2.范德华相互作用

蛋白质分子的中性原子之间发生的偶极-诱导偶极和诱导偶极-诱导偶极的相互作用即为范德华相互作用（也称范德华力）。诱导偶极之间的相互作用包括吸引和排斥作用，不同原子对的范德华力能量在-0.17～-0.8kJ/mol。作用力的大小与原子间的距离有关，随原子间距离增加而迅速减小，当超过0.6nm时，范德华力可以忽略。然而，由于在蛋白质分子中大量原子对参与范德华力，因此它对于蛋白质的折叠和稳定性的贡献很大。

3.氢键

氢键是由与一个电负性原子（例如N、O和S）共价结合的氢原子与另一个电负性原子之间发生的相互作用。图5-8列出了在蛋白质分子中形成氢键的基团。氢键的强度在8.4～33kJ/mol，并取决于参与氢键的电负性原子对的性质和键角。图5-8所示的蛋白质分子中参与形成氢键的基团中，α-螺旋结构和β-折叠片结构中肽键的N—H和C=O基团之间形成的氢键数量最大。

图5-8 蛋白质中形成氢键的基团

氢键的稳定性依赖于环境的介电常数。蛋白质分子二级结构中氢键的稳定性主要依赖于低介电常数的局部环境，后者是由非极性的氨基酸残基侧链的相互作用所造成的，这些庞大的侧链阻止水分子靠近N—H……O=C氢键，从而使氢键得以稳定。

4.静电相互作用

蛋白质分子中含有一些带可离子化基团的氨基酸残基。在中性pH，Asp和Glu残基带负电荷，而Lys、Arg和His残基带正电荷；在碱性pH，Cys和Tyr残基带负电荷。蛋白质分子带净的负电荷或净的正电荷取决于分子中带负电荷和带正电荷残基的相对数目。蛋白质分子净电荷为0时的pH被定义为蛋白质的等电点（pI）。等电点不同于等离子点，后者是指不存在电解质时蛋白质溶液的pH。

蛋白质分子中带相同电荷基团之间的排斥作用会导致蛋白质结构的不稳定。在中性pH，蛋白质分子或带有净的正电荷或带有净的负电荷，蛋白质分子中几乎所有的带电基团（少数例外）都分布在蛋白质分子的表面。另外，在蛋白质分子结构中某些关键部位带相反电荷基团之间的吸引作用对蛋白质结构的稳定性有重要的贡献。然而，这些推斥力和吸引力的强度因水溶液中水的高介电常数而降至很低，静电相互作用的能量减少到±5.8～±3.5kJ/mol。可见，处在蛋白质分子表面的带电基团对蛋白质结构的稳定性没有重要的贡献。

那些部分埋藏在蛋白质内部的带相反电荷的基团，因处在介电常数比水低的环境中而通常能形成相互作用能量较高的盐桥。如果仅仅考虑静电相互作用，那么在pI时，由于蛋白质分子中正电荷和负电荷数目相等，吸引和推斥的静电力达到平衡，蛋白质分子结构是最稳定的；当pH向任何方向远离pI时，蛋白质分子结构会逐渐展开。实际上，在某些蛋白质分子中，稳定蛋白质结构的其他作用力如疏水相互作用能克服静电相互推斥作用。

尽管静电相互作用并不能作为蛋白质分子折叠的主要作用力，然而在水溶液中带电基团倾向于暴露在分子结构的表面确实影响着蛋白质分子折叠的模式。

5.疏水相互作用

由前述可知，在水溶液中，多肽链中各种极性基团之间的氢键和静电相互作用不具有足够的能量来驱动蛋白质的折叠。驱动蛋白质折叠的主要力量来自于非极性基团间的疏水相互作用。

在水溶液中，非极性基团之间的疏水相互作用是水与非极性基团之间热力学上不利的相互作用的结果。如果一个非极性基团溶于水，自由能的变化（ΔG）是正值，即这个溶解过程在热力学上是不适宜的。即使这个过程的ΔH是负值，由于ΔS是一个大的负值，根ΔG=ΔH-TΔS，ΔG仍然是一个正值。一个非极性基团溶于水导致熵变下降（ΔS是一个负值）是由于在非极性基团周围形成了一个笼状的水结构。由于ΔG是正值，非极性基团与水的相互作用受到了严格的限制，因此，在水溶液中非极性基团倾向于缔合使它们与水直接接触的面积降到最低（参见第二章）。在水溶液中由水结构诱导的非极性基团之间的相互作用被称为疏水相互作用。在蛋白质中，氨基酸残基的非极性侧链之间的疏水相互作用是蛋白质分子折叠成特定的三维结构的主要原因，在此结构中多数的非极性基团倾向于避开水的环境。

由于非极性基团的疏水相互作用是非极性基团溶于水的逆向过程，因此ΔG是一个负值，而ΔH和ΔS是正值。与其他的非共价相互作用不同，疏水相互作用是吸热过程，因此疏水相互作用在高温下是较强的，在低温下是较弱的。

6.二硫键

二硫键是天然存在于蛋白质中唯一的共价侧链交联。它们既能存在于分子内，也能存在于分子间。在单体蛋白质中，二硫键的形成是蛋白质折叠的结果。当两个半胱氨酸残基接近并适当定向时，分子氧催化巯基氧化形成二硫键。二硫键一旦形成就有助于蛋白质折叠结构的稳定。例如，当β-乳球蛋白中一个或两个二硫键被还原成巯基（—SH）时，蛋白质构象就失去稳定性，并且更易于被胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等消化。

7.金属离子

一些蛋白质结合着特定的金属离子，例如Ca²⁺、Mg²⁺和Na⁺。这种结合一般能稳定蛋白质的结构，机制或许是通过中和电荷的效应和促进其他的相互作用（例如疏水相互作用）使得蛋白质有一个更牢固的分子构象。牛乳清蛋白天然结构稳定的必需条件是结合钙离子。α-淀粉酶蛋白中存在钙，如果在低pH和同时存在螯合剂的条件下将酶蛋白分子中的钙离子除去，能导致酶基本上失活和对热、酸或脲等变性因素的稳定性降低。

总之，一个独特的蛋白质三维结构的形成是各种排斥和吸引的非共价相互作用以及共价二硫键共同作用的结果。

天然蛋白质结构的稳定性定义为蛋白质分子天然态和变性态（展开态）的自由能差值，通常用ΔG_D表示，即蛋白质分子从天然态展开为变性态所需的能量。前面提到的非共价相互作用（除静电相互排斥作用外）都起着稳定天然蛋白质结构的作用。这些相互作用产生的总的自由能变化为20～85kJ/mol。导致天然蛋白质结构不稳定的主要作用力是多肽链的构象熵（Conformational entropy）。当一个随机状态的多肽链折叠成一个紧密状态，蛋白质分子因各种基团的移动、转动和振动而导致构象熵的降低。于是蛋白质分子在天然态和变性态之间自由能的差别可用下式表示

式中 ΔG_H-bond、ΔG_ele、ΔG_HΦ和ΔG_vdw—分别表示形成氢键、静电相互作用、疏水相互作用和范德华相互作用所产生的自由能变化；

ΔS_conf—多肽链从天然态转变成变性态时构象熵的变化。

ΔG_D表示G_D-G_N，G_D和G_N分别为蛋白质分子处在变性态和天然态的自由能，因此ΔG_D是蛋白质分子展开时所需的能量。一些蛋白质的ΔG_D值如表5-8所示，尽管蛋白质中存在大量的分子内相互作用，然而蛋白质分子仅具有脆弱的稳定性。例如，多数蛋白质的ΔG_D相当于1～3个氢键或2～5个疏水相互作用的能量当量。可以推测，打断几个非共价相互作用或许能使许多蛋白质的天然结构失去稳定性。

蛋白质并非是刚性的分子；相反地，它们是高度柔性的，天然态是一种介稳定状态。蛋白质分子结构的细微变化并没有导致分子结构剧烈的改变，此种变化通常被称为蛋白质的“构象适应性”。

蛋白质构象对环境的适应性对于蛋白质执行某些关键性的生理功能是必要的。例如，酶与底物或辅基的有效结合肯定涉及多肽链在结合部位的重排。另一方面，具有生理功能的蛋白质通常依靠分子内的二硫键来维持其结构的稳定性，二硫键能有效地减少构象熵（即减小多肽链展开的倾向）。

表5-8 一些蛋白质的ΔG_D