静态顶空法的缺陷及其应用：以甘露糖蛋白为例

（一）概述

静态顶空（Static Headspace）取样是将样品放在一个密封的小瓶中，在常温或加热条件下，经搅拌（或振荡）一定时间，可达到气液平衡，用注射器抽取顶空气体进样分析（图6-4）。静态顶空的主要缺陷是敏感性差。分析物的浓度越低，需要的样品体积就越大。气相色谱的允许进样体积一般不超过10mL，因此用气相色谱-氢火焰离子化检测法（GC-FID）时只能检测到顶空气体中浓度大于10^-7g/L的成分，而用气相色谱-质谱联用测定法（GC-MS）时只能检测到顶空气体中浓度大于10^-5g/L的成分。食品的香气中，样品组分在顶空气体的浓度一般10^-4～10^-10g/L或更低。因此，静态顶空取样，适于检测的是样品顶空中那些含量丰富的成分或能够释放出含量较浓的头香物料（如鲜花）的香气成分。在自动化静态顶空时，进样阀和传输线温度一般稍高于样品温度以免挥发性物质冷凝，但过高的温度会因为气体的膨胀，导致进入定量管的样品相对浓度变小，使分析灵敏度降低。

图6-4 静态顶空的典型装置

1—注射器 2—密封隔垫 3—螺帽 4—容器 5—样品 6—恒温浴 7—温度计

（二）静态顶空取样的优缺点

优点：①不使用溶剂、无环境污染、节约费用、低沸点成分的谱峰不受溶剂峰的干扰；②使用自动化装置，简单、快速、可一次性处理多个样品。

缺点：①适于分析挥发性强的成分，对挥发性弱的成分敏感性差；②顶空气体的组成受平衡温度、平衡时间、样品瓶体积、基质效应等多个因素的影响；③灵敏性差，浓度较低的挥发性成分，仪器无法检测到。

（三）静态顶空取样的影响因素

1.样品性质

在一定条件下，样品达到平衡时，液体和固体样品中存在着气-液或气-固两相，甚至气-液-固三相。顶空气体中各组分的含量与它们各自的挥发度有关，又与样品的基质有关。待测组分在气相和样品中浓度的比值，称为分配系数（k）。一般挥发度较小或在样品基质中溶解度较大的组分，分配系数较小，“基质效应”达到相平衡时，顶空气体中的浓度较低。

在实际应用中，常用如下方法减弱基质效应并增大分配系数：

（1）盐析作用 在样品体系中加入无机盐（如氯化钠），可使挥发性组分在样品中的溶解度减小，从而增大其分配系数。加入盐量的多少，应根据待测组分的性质确定。一般而言，盐析作用对极性组分的影响远大于对非极性组分的影响。

（2）样品中加入水 多数挥发性组分是亲脂性的，在样品中加入水，挥发性组分在样品中的溶解度会降低，从而有利于挥发性组分向顶空中扩散。例如，在测定聚合物中的丙烯酸-2-乙基己酯残留量时，样品溶于二甲基乙酰胺（有机溶剂）中，然后加入水，分析灵敏度可提高数百倍。

（3）调节溶液的pH对于弱碱性组分和弱酸性挥发性组分，通过调节样品体系的pH，可使这些组分以非电离形式存在，从而可增大它们在气相中的浓度，提高分析的灵敏度。

2.样品体积(www.xing528.com)

样品的体积对分析结果有影响，因为它与相比β（样品体积与顶空体积的比值）直接相关。一般来说，样品体积增大，检测的灵敏度会随之增加，但样品体积的影响还要依据测组分的性质来定。分配系数较大的组分，受样品体积的影响较为敏感，而分配系数较小的组分，受样品体积的影响较小。例如，水溶液中的二氧六环和环己烷，用20mL的样品瓶在60℃平衡，当样品量由1mL变为5mL时，二氧六环的分析灵敏度只提高了1.3%，而环己烷却提高了452%。因此，在平行实验时，应尽量保持各份样品的体积一致，分析结果才能具有较好的重现性。

此外，样品体积的大小还受样品量和样品瓶容积的限制。样品体积的上限是充满样品瓶容积的80%，在实际分析时常采用样品瓶容积的50%为样品体积。

3.平衡温度

一般来说，温度越高，蒸气压越高，顶空气体的浓度越高，分配系数越大，分析灵敏度也越高。但温度的提高只是对分配系数较小的组分影响较大。

此外，温度高时可使平衡时间缩短。但香气分析中，在满足灵敏度的条件下，常选择较低的平衡温度，以防止某些组分的分解和氧化（样品瓶中有空气）。此外，若温度较高，会造成顶空瓶内的压力过大，引起顶空瓶或仪器系统的漏气。

4.平衡时间

采用静态顶空装置分析时，当样品瓶内达到相平衡时，才能取样分析。样品的平衡时间往往比气相色谱（GC）分析时间长，缩短平衡时间是提高样品分析速度的关键。

本质上，平衡时间取决于被测组分从样品基质扩散到气相中的速度。分子的扩散系数越大，所需的平衡时间越短。扩散系数与分子结构、介质黏度及温度有关。温度较高时，样品黏度较低，扩散系数越大，平衡时间较短。釆用搅拌技术，如机械搅拌或电磁搅拌也可缩短平衡时间。实验证明，对于分配系数小，在样品基质中溶解度大的样品，可通过搅拌方法使平衡时间缩短一半以上。但对于分配系数大的样品，影响相对小得多。

平衡时间还与样品的体积有关。体积越大，所需的平衡时间越长。而样品体积又与分析灵敏度有关，对于分配系数小的组分，若通过增大样品体积提高分析灵敏度，所需平衡时间就相应增加。对于分配系数大的组分，用小的样品体积时就可获得较高的灵敏度，因而平衡时间较短。

固体样品比液体样品所需的平衡时间长。除了提高温度外，常用减小固体颗粒的粒径，增大比表面的方法缩短平衡时间。此时，用冷冻粉碎技术较好，因一般的粉碎方法会使样品发热，挥发性组分丢失。此外，将固体样品溶解在适当的溶剂中或用溶剂浸润固体样品中，也可以减小固体表面对待测物的吸附作用，缩短平衡时间。但样品稀释后，会降低检测的灵敏度。

（四）静态顶空的应用

Boland A B等用静态顶空分析法，测定了果胶和动物胶中草莓香气化合物的气-胶分配系数。Chalier P等用静态顶空法，研究了甘露糖蛋白和分离后的甘露糖蛋白中4种芳香化合物之间的相互作用。Helmut Guth等为了比较乳蛋糕和乳粉在油-水模型体系中的香气特征，通过静态顶空-气相色谱法分析出了γ-和δ-辛内酯、γ-和δ-壬内酯、γ-和δ-癸内酯、己酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、2-苯基乙醇等香气成分。Carrapiso A I采取静态顶空技术，研究了脂肪含量对腊肠香气的影响，得出了脂肪对生腊肠香气的贡献大于煮熟后腊肠的结论。

王昊阳等运用静态顶空-毛细管气相色谱-质谱法对天然香精中挥发性化学成分进行了分析，采用质谱和保留指数检索结合的方法，对香精中挥发性成分进行定性分析，并对香精顶空分析条件进行了优化。结果表明，通过向香精样品中加入适量饱和NaCl溶液，显著地提高了低极性挥发性组分的分析灵敏度。雷安亮等采用正交试验、静态顶空-气相色谱法，研究了样品量、平衡温度、平衡时间、离子强度等影响因子对静态顶空-气相色谱法测定葡萄酒中香气物质的影响，获得了最佳的分析条件。