（一）概述
红霉素（erythromycin，Er）是红色糖多孢菌的次级代谢产物，其抗菌谱和青霉素G相似，特别对抗酸杆菌、革兰阳性细菌、大病毒及立克次体有抗菌活性。红霉素为十四元大环内酯类抗生素，其分子是由红霉素内酯、红霉素糖和脱氧氨基己糖三部分组成。硫氰酸红霉素的分子结构式如图11-31所示。
图11-31 硫氰酸红霉素分子结构式
硫氰酸红霉素不仅是兽用抗生素，还是大环内酯类原料药的母核，是合成国际医药市场上十分畅销的三大半合成红霉素（阿奇霉素、罗红霉素和克拉霉素）的关键中间体原料，从而，奠定了硫氰酸红霉素在国际医药原料药市场上的强势地位。
我国早在上世纪60年代已开始生产红霉素，80年代末至90年代初才开始试生产硫氰酸红霉素。进入21世纪，国际市场包括我国对硫氰酸红霉素的需求不断上升。
（二）红霉素生产工艺
红霉素发酵是以红色链霉菌（streptomyces Erythreus）为生产菌种，孢子经过斜面培养后，进行菌丝摇瓶培养，然后接入一、二级种子罐培养，经检验质量合格后，接入发酵罐，通入无菌空气，开搅拌，严格控制罐温、罐压，并通过调节空气流量和搅拌转速控制溶氧，进行深层液体发酵。
发酵生产中的培养基主要采用淀粉和葡萄糖作为碳源，豆饼粉、玉米浆和硫酸铵等作为氮源。在发酵过程中，定量流加前体丙醇，根据pH变化流加液化糖，同时依据补糖量流加黄豆油。菌丝在代谢过程中不断分泌红霉素。经过8d左右发酵，菌丝产生一定数量红霉素后，开始衰老断裂，即可放罐提取。
红霉素是一种碱性抗生素，在碱性情况下易溶于醋酸丁酯等有机溶剂，而在酸性时溶于水中，可与某些无机酸和有机酸形成盐，因此，主要采用溶媒萃取法提取。先将发酵液进行预处理，得到滤液，将滤液pH调至9.8～10.2，用醋酸丁酯提取，然后在丁酯相中加入硫氰酸钠，用冰醋酸调pH4.5～4.8，形成硫氰酸红霉素盐，以提纯红霉素，制备符合兽药典规定的硫氰酸红霉素。红霉素发酵的主要技术经济指标如表11-25所示。
表11-25 红霉素发酵主要技术经济指标
下面具体介绍某企业红霉素发酵生产工艺。
1. 菌种工艺
（1）斜面孢子制备 菌种为红色糖多孢菌（EM61）。斜面培养基成分：淀粉0.5%，葡萄糖0.5%，鱼胨0.5%，玉米浆0.1%（湿重），氯化钠1.0%，磷酸二氢钾0.015%，甜菜碱盐酸盐0.05%，氯化钙0.008%，微量元素溶液0.2mL/100mL，琼脂2.0%～2.2%。消前pH7.0（20%KOH调整）。
称量后，先将淀粉糊化，在与其他成分混合配成预定体积，待调pH后，分装在茄型瓶中，经118～120℃、0.1MPa下灭菌30min后，摆成斜面，置于34℃恒温培养5～7d，待冷凝水蒸发干后，观察无杂菌生长即可使用。
准备好沙土管及空白斜面，按无菌操作法用沙土孢子或冷干管中的牛乳孢子接种，置于（34.0±0.5）℃，相对湿度40%～50%，培养8～9d，长好后直接用于生产或置于4℃冰箱保存备用。斜面生长过程及变化如表11-26所示。
表11-26 斜面培养时间及其变化情况
续表
斜面孢子特征：高产菌落边缘圆、灰色，中间凸起正中有凹陷、中间白色，个别有梅花型，扎根较深。
（2）摇瓶菌丝制备 培养基配比：蔗糖3%，玉米浆1.6%，硫酸铵0.2%，碳酸钙0.7%，黄豆油0.5mL/300mL三角瓶，20%NaOH调pH5.5左右。培养条件：在34℃、220～240r/min摇瓶机振荡培养24h左右。
2. 发酵工艺
（1）培养基配比 种子罐和发酵罐培养基配比如表11-27所示。
表11-27 种子罐和发酵罐培养基配比
（2）培养基灭菌 中、小罐及糖、油罐均采用实罐消毒方式进行灭菌，正丙醇采用闷消方式灭菌。发酵罐采用连续灭菌方式灭菌。其灭菌压力、温度和时间如表11-28所示。
表11-28 各类罐体灭菌条件
消毒时，小罐、中罐、油罐及糖罐均预热到70～80℃再进汽。大罐配料时预热到65～70℃时打料。正丙醇管道的消毒压力必须保持在0.2MPa，消毒45min。丙醇计量罐，一般每周消毒一次。油管道消毒压力0.2MPa，时间为45min左右。糖管道消毒压力0.3MPa，时间为60min左右。种子罐和发酵罐培养基消后质量标准如表11-29所示。(www.xing528.com)
表11-29 种子罐和发酵罐培养基消后质量标准
（3）一级种子培养 培养基灭菌后，罐温降至37℃时，采用微孔压差法将摇动瓶种子或孢子接入罐中培养。罐温全程控制在（34.0±0.5）℃，通入无菌空气，通风比0.8～1.0/min，罐压0.05MPa，全程开搅拌，转速140r/min。培养过程中每过段时间需取样作无菌试验，测pH、菌体沉淀物体积（PMV），10h后取样观察菌丝形态，30h开始测黏度。
培养33h左右菌丝形态呈网状，菌丝体粗壮，分枝少，染色深且均匀，PMV在12%以上，pH回升至6.6左右，无杂菌，即可移入二级种子罐。
（4）二级种子罐培养 培养基灭菌后，罐温降至34℃时，用压差法将符合质量要求的一级种子接入二级罐中。全程控制罐温（34.0±0.5）℃，通风比保持0.8～1.0/min，罐压控制0.05～0.06MPa，全程搅拌，转速130rpm。培养过程中，每过段时间需取样作无菌试验，测pH、PMV、黏度，观察菌丝形态。培养13h左右，镜检菌丝呈网状，菌丝体细、长、直、分枝少，染色均匀，P MV在20%以上，无杂菌，即可移入大罐。
（5）发酵罐培养 培养基灭菌后，罐温降到36℃时，将搅拌转速调到80r/min，空气流量调至3000m3/h，罐压维持在0.025MPa，调溶氧显示100%，然后停搅拌接种，接种后，罐温控制（34.0±0.5）℃，搅拌转速80r/min，空气流量3000m3/h。培养过程中控制溶氧、pH，并流加补入糖、醇、油，其原则：
①溶氧控制：100h前控制在（50±5）%，100h后控制在（40±5）%。当溶氧降至控制范围底限时，依次交替提高搅拌转速和空气流量，使溶氧在控制范围内。
②pH与补糖控制：通过补糖来控制pH。24h前，当pH降至最低又回升至7.1时，开始缓慢补糖，控制pH在7.2～7.3。24～40h控制pH在7.0～7.05，40h后控制pH在6.9～6.95。放罐前1h停止补糖，pH回升。
③补醇控制：发酵12h后，当发酵液PMV达到30%时，开始补醇，速率0.08～0.09mL/（L/h），放罐前5h停止补醇。
④补油控制：发酵24h后，根据补糖速率确定补油速率，当糖耗大于20kg/h时开始补油，糖耗小于48kg/h时按0.092mL/（L/h ）补油；在48～60kg/h按0.145mL/（L/h）；在60kg/h以上按0.215mL/（L/h）补入。放罐前8h停止补油。
（6）发酵过程菌丝形态生长变化 发酵过程菌丝形态生长变化情况如表11-30所示。
表11-30 发酵过程菌丝形态生长变化情况
3. 提取工艺
（1）预处理 将发酵液放入预处理罐，待放到一半时，开启搅拌和空气搅拌（如有空气搅拌），边放罐边加ZnSO4和15%～20%的NaOH维持pH7.0～8.0，待发酵液放完时，加够ZnSO4 ，调节pH8.0～8.4。ZnSO4加入量控制在30～50g/L，并控制滤速在8mL/5min以上，ZnSO4尽量少加，然后进板框压滤机压滤。
发酵液预处理工艺控制点：发酵液的碱化pH控制在8.0～8.4，滤液pH控制在7.5～8.0，温度20～30℃，滤液单位2500～4000U/mL，NaOH配制浓度20%。
（2）萃取（采用二级逆流静态提取）在提取罐中加入上批二级提取的丁酯（如是第一次，则加入新鲜丁酯），将已经用15%～20% NaOH溶液调好pH 10.1 ± 0.1的碱化液（调碱后的滤液）打入提取罐中。边打边滴入2%的破乳剂。打完后，开动空气搅拌8～10min。静置1h后分层，转出下层水相进入另一罐进行二级萃取（新鲜丁酯已经打入备提取用）。上层丁酯相经碟片式高速离心机分离，分离出清亮透明丁酯相即为红霉素抽提轻液。
二级萃取操作同一级萃取操作一样，但要复测pH。如果pH不符合要求，加入20%的NaOH溶液调节pH至规定值。然后静置1h分层，水相最终控制单位低于200U/mL以下。废水打入回收岗位蒸馏回收丁酯。上层丁酯相经碟片式高速离心机分离后储于储罐中备用，用于下批一级萃取用。
醋酸丁酯萃取工艺控制要点：pH以pH计测定为准，一级萃取pH 10.1 ± 0.1，二级萃取pH 10.5 ± 0.1；醋酸丁酯加入量一级按1/12～1/13（体积分数）加入，二级按1/15～1/16（体积分数）加入；抽提温度32℃左右；丁酯萃取液要求清亮，无明显乳化层。
（3）成盐结晶 将分离轻液打入结晶罐中，升温至43℃，加入1/10（体积分数）的饱和食盐水搅拌洗涤15min，然后静置45min分层，分尽下层乳化层和水。连续洗涤三次。洗涤后，开动搅拌，缓缓加入已经配制好的硫氰酸钠溶液，先慢后快，控制加入时间不得少于45min。滴加入50%的冰醋酸溶液，调节pH4.6～4.8。先慢后快，控制加入至调好pH的时间不得少于45min。继续搅拌30min后，停止搅拌，冷却降温，静置30min后，温度降到28℃以下，即可开始分离。
工艺控制要点：轻液洗涤温度40～43℃，用饱和食盐水洗涤；硫氰酸钠加量以10亿单位为准，按0.2kg/10亿加入；成盐pH控制4.6～4.8，温度43℃左右；硫氰酸钠浓度配制成20%，冰醋酸浓度配制成50%。
（4）分离洗涤 将成盐结晶液放入抽滤缸真空抽滤。抽滤缸中的湿盐用适量新鲜丁酯浸泡挖洗，约10min后再真空抽干。将湿盐转入混洗缸中，加入1～1.5倍的热蒸馏水充分混洗，离心，再用热蒸馏水淋洗2～3次，直至洗出的蒸馏水表面无明显溶媒即可。
工艺控制要点：过滤后用新鲜丁酯泡洗一次；蒸馏水温度控制在50～60℃。
（5）干燥包装 将湿盐放入喷雾干燥器中，通入75～80℃的热空气加热干燥2～3h。干燥后，收入桶中密闭保存，同时称重，通知质控部门取样检验。检验合格，按质控部门的包装通知进行包装，然后办理成品入库。
工艺控制要点：空气必须经高效过滤膜过滤；控制空气温度在75～80℃。
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