（一）概述
透明质酸（Hyaluronic Acid，HA），又称玻尿酸，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖为双糖单位聚合而成的直链式酸性高分子黏多糖，结构式如图11-30所示。透明质酸溶于水、不溶于有机溶剂。从生物体提取的透明质酸呈白色，无异味、具有很强的吸湿性。透明质酸在氯化钠溶液中由于葡萄糖醛酸中的羧基基团解离，产生的H+使得呈现为酸性多聚阴离子状态，赋予了透明质酸酸性黏多糖的性质。透明质酸具有高保湿性、黏弹性和生物相容性等许多优良性质，因而在生物医药、化妆品和保健食品等领域具有广泛应用。
透明质酸具有广泛的用途，因而，大规模制备透明质酸是十分必要的。目前常用的制备技术有两种：一是利用天然原料即从动物组织中提取，主要原料是人的脐带、鸡冠或牛眼玻璃体等。用丙酮或乙醇等有机溶媒将原料脱脂、脱水、风干后，用蒸馏水浸泡、过滤，然后以氯化钠水溶液和氯仿溶液处理，之后加入胰蛋白酶保温后得到混合液，最后用离子交换剂进行处理、纯化得到精制的透明质酸。组织提取法工艺简单，获得的透明质酸分子量较大，黏度高，保湿性能好。但由于原料有限，且原料中的透明质酸含量低，同时又与硫酸软骨素等黏多糖共存于组织中，故此法产量低、质量差、成本高，难以大规模生产。二是生物发酵法，主要以葡萄糖作为碳源，发酵48h后，过滤除去菌体和杂质，然后用醇沉淀法得到高纯度的透明质酸。发酵法的关键在于菌种的选择，目前所用的菌种主要有兽疫链球菌、马疫链球菌和类马疫链球菌等。动物组织提取法和发酵法生产透明质酸的比较如表11-12所示。
图11-30 透明质酸结构式
表11-12 动物组织提取法和细菌发酵法生产透明质酸的比较
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因此，发酵法生产透明质酸具有产量不受动物原料资源的限制，成本低，分离纯化工艺简单，易于规模化生产等优点，是透明质酸生产的发展方向。目前，应从提高透明质酸产率，提高产品相对分子质量和分离纯化技术方面进行深入研究。
透明质酸发酵工艺中，大多数采用有氧发酵。有氧发酵有利于UTP生成，而UTP是生成透明质酸的两个活化前体物（UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖）所必需的。因此，从代谢调控的角度，有氧发酵有利于透明质酸的合成，且透明质酸产率高、相对分子质量大。在有氧发酵中，不同的溶氧量会对菌体增殖、透明质酸的合成以及副产物的形成产生很大影响。因而，在发酵过程中通常保持一个适当的溶氧量，且在不同的阶段采用不同的溶氧量，是提高发酵产率的有效手段之一。
发酵生产透明质酸所用的培养液中，氮源为蛋白胨、酪蛋白水解液、酵母粉、牛肉膏等。其中，酵母粉最为常用，除作为氮源外，还含有多种维生素和生长因子，有些是链球菌生长所必需的。碳源主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解物，最常用的是葡萄糖，要求药品级口服葡萄糖，其他还有PO4 3-、SO42-、K+、Na+、Ca2+、Mg2+等无机盐。
兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）发酵法生产透明质酸的关键步骤是培养基和发酵条件的优化。该菌对培养基和培养条件要求非常严格，因为兽疫链球菌代谢途径会严格受到培养基的配方以及比例的影响，同时兽疫链球菌对氧气的供给比较苛刻，高搅拌速率能显著提高透明质酸的分子量，但过高的速率会破坏分子链反而降低透明质酸的分子量，因此发酵过程中搅拌桨的转速和通气量要受到严格控制，搅拌速度通常控制在100～800r/min。发酵过程中，温度通常为37℃，pH控制在6.0～8.5范围内，过酸过碱的环境都会影响菌体生长，降低透明质酸的产率。
（二）透明质酸的发酵生产
下面按照1m3发酵罐为例介绍某企业的透明质酸的发酵工艺技术，该发酵工艺采用两级发酵，摇瓶菌种进罐方式，发酵罐接种量10%，发酵过程中需要补液碱和糖。发酵周期18～24h，发酵单位5～5.5g/L，总收率≥75%。
1. 培养基的配制
分离平板、斜面的培养基相同，分离平板采用Φ90培养皿，斜面采用750mL茄瓶，培养基配比如表11-13所示。
表11-13 分离平板和斜面培养基配比
使用纯化水配制，灭菌前使用10%的液碱调pH至6.8～7.2。灭菌工艺为121℃、20min。
种子瓶、生产摇瓶培养基相同，种子瓶采用500mL三角摇瓶，装量50mL，生产摇瓶采用5L大三角摇瓶，装量500mL。种子瓶和生产摇瓶培养基配比如表11-14所示。
表11-14 种子瓶和生产摇瓶培养基配比
使用饮用水配制，灭菌前用10%的液碱调节pH至6.8～7.0。灭菌工艺为121℃、20min。接种后置于37℃下培养20～22h。培养成熟的种子具有的特性：pH下降至6.1，残糖小于1.0，透明质酸含量大于2g/L。
发酵瓶采用500mL或750mL的三角摇瓶，装量为50mL。发酵瓶培养基的配比如表11-15所示。
表11-15 发酵瓶培养基配比
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将原料投入到摇瓶中，使用液碱调整pH 6.8～7.2，计料体积50mL，控制灭菌后体积45mL。灭菌工艺为121℃、20min。
2. 菌种的分离纯化
生产透明质酸的产生菌为经过重组的兽疫链球菌，遗传性能稳定，菌种的制备和保藏与常规的链球菌工艺相似。镜下观察呈圆球状，常见多个细菌连在一起，呈链状，故称链球菌。以透明质酸为主要成分的荚膜围绕在菌体周围，保护细菌免受伤害。
（1）初筛将保藏的高产兽疫链球菌冻存管菌种制成菌悬液，经梯度稀释后涂布到分离平板上，每个平板涂布0.2mL稀释菌液。培养温度为（36.5±0.5）℃，通常培养30h即可长出合适的单菌落。培养时，前5h正置平板，后倒置平板培养。在平板上选取合格的单菌落接种于茄瓶斜面上。合格单菌落的特点：菌落直径2～3mm，表面粗糙，微皱褶，菌苔圆形微突起，灰白色，培养时间较长时，背面会有棕色色素。斜面培养温度为（36.5±0.5）℃，湿度40%～60%，通常培养2d即成熟。
刮取约（0.5×0.5）cm2的斜面菌层，接种到种子瓶中。置于（37.0±0.5）℃的摇床中，转速220rpm，培养16～22h得到成熟种子液。把成熟的种子液接种到发酵瓶中，接种量为10%。置于（37.0±0.5）℃的摇床中培养，转速220r/min，相对湿度40%～60%。30h放瓶，通常选取发酵单位高于5000μg/mL的斜面进行复筛。
（2）复筛将初筛斜面扩培至新斜面上，置于（36.5±0.5）℃、湿度40%～60%下培养，约7d成熟。按照“成熟斜面→种子瓶→发酵瓶”的流程复筛，复筛的发酵单位仍然要高于5000μg/mL。
（3）生产摇瓶种子的制备 选取经过复筛的斜面接种于生产大摇瓶中，接种量：2cm2菌苔/50mL种子液，然后置于（36.5±0.5）℃的摇床中培养，转速220r/min，20～26h得到成熟的生产摇瓶种子液。
由于采用挖块接种的方式会带来接种量不均匀的问题，因此也可使用适量无菌水（40mL）将斜面菌苔洗下，振荡均匀后吸取5mL接种于生产摇瓶中。
成熟的生产摇瓶种子液应有如下特性：OD≥10.0， pH降至6.1左右。
3. 发酵工艺
（1）种子罐培养基的配制与培养 一级种子罐的培养基如表11-16所示。
表11-16 一级种子罐培养基配比(www.xing528.com)
100L的一级种子罐计料体积为70L，在种子罐内加入适量（50L）饮用水，按照配比投入全部原料，加水补足计料体积，确认灭菌前的体积为60L，温度为35～42℃。通过种子罐夹套中通入蒸汽预热至100℃，然后开始升温至120～122℃，灭菌30min。
灭菌结束后降温至40～50℃后，停止搅拌，确认消后体积为（12±1）m3，pH6.9～7.2，待接种。
接种前需确认摇瓶种子液OD≥10.0，接种量50mL/100L。一级种子罐培养条件：培养温度（36.0±1.0）℃，罐压0.05MPa，通风比1/min，搅拌转速200r/min，培养周期14h（10～20h）。
优良一级种子液的指标：菌浓≥18%，pH下降到6.8～6.9。菌浓测定采用3000r/min离心10min的方法。
（2）种子罐生产实例（100L种子罐）接入摇瓶菌种质量指标：培养周期20h，放瓶pH 6.1，OD5308.3，菌种量500mL。
种子罐计料体积80L，灭菌前pH 6.53，没有使用液碱调节，灭菌前体积70L，温度42℃，灭菌工艺为121℃、30min，灭菌后实际体积80L。100L种子罐基本培养条件如表11-17所示。
表11-17 100L种子罐基本培养条件
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（3）二级发酵罐培养基的配制与培养 发酵罐培养基的配比如表11-18所示。
表11-18 发酵罐培养基配比
1m3的发酵罐计料体积800L。pH在6.90～7.10，如果pH不合格，需要使用稀盐酸或液碱调整到合格范围内。接种量为10%（100L→1m3 ），实际接种量80L。发酵罐的培养条件如表11-19所示。
表11-19 1m3发酵罐发酵培养条件
另外，还需要控制以下指标：
①溶氧控制：发酵接种前调整空气流量、搅拌转速等指标，控制pH，在10h后出现溶氧低谷，全程要确保pH在6.8～7.2。后期当pH变化频繁时，可适当提高空气流量和搅拌转速。
②补糖：当培养到10h的左右，根据补碱频率约5～7次/min，一次性补糖。
③pH控制（液碱）：使用工业液碱控制发酵液pH，前期5h以后开始补碱，随着pH的变化，补碱的频率越来越频繁。
（4）发酵生产实例（1m3）计料体积800L，投入培养基后pH为5.21，投入液碱调至pH7.0，消前液量650L，温度59℃，消后体积720L。发酵条件控制如表11-20所示。
表11-20 1m3发酵罐发酵控制条件
注：罐压控制0.05MPa；搅拌转速控制100～120r/min。
（5）发酵罐生产指标 发酵罐生产指标汇总如表11-21所示。
表11-21 发酵罐生产指标汇总
4. 提取工艺
放罐前洗刷絮凝罐，再加入发酵液3倍体积的酒精，发酵液冲入絮凝罐后开空气翻腾10min左右，停空气，静置至半成品浮出后，捞出半成品脱水，将捞好的半成品用回收酒精浸泡过后，换至新的回收酒精中，浸泡12～24h，离心10min后，称重，做好记录。
在溶解罐中加入1200L水，加热至50～55℃。称取半成品18kg（离心甩干撕碎）加入溶解罐中，然后加入200mL甲醛，搅拌至完全溶解，此时，加入200L左右酒精并加入360mL（无水碳酸钠10%）碳酸钠溶液。10min后，用浓度23%～25%的碱液调pH8.4～8.6，加碱时应缓慢。pH调好后，分4次加入活性炭，每次加900g，活性炭先用30L水搅拌均匀后再加入溶解罐内，开始加活性炭后需随时测pH，要控制在8.4～8.6。加活性炭期间，每间隔15～20min在溶解罐内加珍珠岩粗12kg或细8kg（溶于100L纯水）并混合均匀，控制pH8.4～8.6。
物料混合液经板框过滤，透光率达到98%以上进中间罐，然后在中间罐中加入1.6kg活性炭（预先用20L纯水调好）搅拌均匀，调pH到5.4～5.6，停搅拌吸附1h，然后再经几次过滤，直至透光率达到100%以上进制粉罐。
5. 制粉和干燥
过滤液进入制粉罐，调pH 5.4～5.6。边搅拌边缓慢压入等体积酒精（pH7.0，流速1m3/h），再以5s1勺的速度加入饱和盐水，直至有粉末析出，然后缓慢加入两倍酒精（pH7.0，流速1.2m3/h），沉淀30min，抽出上清液，从底部放出所需产品。产品沉淀后吸去上层酒精，用回收酒精（浓度95%以上）脱水1次（24h）；产品再一次沉淀后吸去上层酒精，用新酒精（浓度95%以上）脱水一次（24h）。离心机甩干后，用无水乙醇脱水1次，最后离心机甩干，并使用双锥回转真空干燥器对透明质酸湿晶体进行真空干燥15h左右，水分控制在9%以下，经分析合格后，进包装。
6. 成品透明质酸相关指标
透明质酸理化、卫生及毒性试验指标分别如表11-22、表11-23、表11-24所示。
表11-22 透明质酸理化指标
表11-23 透明质酸卫生指标
表11-24 透明质酸毒性试验
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