柠檬酸发酵生产工艺简介

（一）概述

发酵生产有机酸是重要的工业领域，我国是世界上最早利用和发酵生产有机酸的国家之一。目前，柠檬酸和乳酸系列产品已进入国际市场；苹果酸和衣康酸已大规模生产；葡萄糖酸的发酵生产已进入成熟阶段；聚乳酸（PLA）塑料的问世使L-乳酸的应用领域扩大到化工、环保等方面，前景喜人。在众多有机酸发酵产品中，柠檬酸的规模和发展速度最大，占酸味剂市场的70%左右。

目前柠檬酸的生产都是采用微生物发酵法，用于柠檬酸工业化生产的菌种广泛采用黑曲霉。但是，以石油、乙酸、乙醇等为原料时，只有酵母才能作为柠檬酸的生产菌株，如解脂假丝酵母、热带假丝酵母等。但是酵母利用石油原料生产柠檬酸时会产生相当数量的异柠檬酸。

高产柠檬酸的黑曲霉菌株主要的特征：①在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长不太好，菌落较小，形成孢子的能力也较弱；②能耐受高浓度的葡萄糖，并产生大量酸性α-淀粉酶和糖化酶，即使在低pH下两种酶仍具有大部分活力；③能耐高浓度柠檬酸，但不能利用和分解柠檬酸；④能抗微量金属离子，特别是抗Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺和Fe²⁺等金属离子；⑤在摇瓶和深层液体培养时能产生大量细小的菌丝球；⑥具有旁系呼吸链活性，利用葡萄糖时不产生或少产生ATP。

柠檬酸的发酵机理：柠檬酸是TCA循环代谢过程的中间产物，在正常情况下，柠檬酸在细胞内不会积累，且柠檬酸是黑曲霉的良好碳源。柠檬酸积累是菌体代谢失调的结果，黑曲霉发酵过程中，在高浓度葡萄糖、低pH和充分供氧的条件下，由于Mn²⁺的缺乏，NH₄⁺的浓度升高，柠檬酸对磷酸果糖激酶（PFK）的反馈抑制作用被解除，促进了EMP途径；控制Fe²⁺的浓度，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性丧失或很低，TCA循环被阻断，因而，柠檬酸大量积累并排出菌体外。柠檬酸代谢途径如图11-24所示。深层通气发酵是柠檬酸发酵生产的主要方法。国内以淀粉质原料为培养基，发酵产酸一般为11%～13%，最高达15%，糖酸（一水柠檬酸）转化率90%～104%，发酵周期为50～70h。深层发酵法的一般生产工艺流程如图11-25所示。

图11-24 柠檬酸代谢途径

注：PFK-磷酸果糖激酶

黑曲霉是需氧菌，其生长繁殖和维持生命活动以及由葡萄糖转化为柠檬酸时都需要一定的氧气。在一定范围内培养基的溶氧分压几乎与产酸成正比，溶氧分压低，产酸明显受影响或甚至完全不产酸。在发酵15～30h，菌体大量生长繁殖耗氧量最大，而产酸阶段耗氧虽略有减弱，但在这一时期只要几分钟的缺氧造成的影响是不可逆的，甚至发酵失败，因此，在整个发酵过程中不能停止通气和搅拌。采用加大空气流速及加快搅拌速率的方法，使培养液中溶氧达到60%饱和度对产酸有利。

图11-25 我国深层发酵柠檬酸基本工艺流程

柠檬酸的发酵过程还需要掌握一定的温度、pH等条件。一般认为，黑曲霉适合在28～30℃时产酸。温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。微生物生成柠檬酸要求低pH，最适pH为2～4，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。

黑曲霉发酵生产柠檬酸时会形成大量的菌丝球，所谓菌丝球是指由许多真菌菌丝缠绕而成的小球，是由菌球中心向四周辐射的分支菌丝构成的。菌丝球的形态、大小和数量对产酸有明显影响，若发酵后期形成正常的菌丝球，有利于降低发酵液黏度并增加溶氧，产酸量就高，一般认为，发酵过程只有形成小而紧密、核心部分呈空心状的菌丝球产酸才良好。因为这种菌丝球增大了菌丝与培养基接触界面，利于对营养物质和溶氧的吸收，同时形成菌丝球改善培养基的流体性质，利于氧的传递。若出现异形菌丝体，如产生分支状菌丝体或菌丝球伸“脚”菌丝太多，菌体大量繁殖，则造成溶氧降低，产酸量迅速下降。

柠檬酸发酵液中，除主要产物外，还含有其他代谢产物和一些杂质，如草酸、葡萄糖酸、蛋白质、胶体物质等，应通过物理或化学方法将柠檬酸提取出来。大多数工厂仍采用碳酸钙中和及硫酸酸解的钙盐法提取柠檬酸，钙盐法提取工艺如图11-26所示。此外，还可用萃取法、电渗析法和离子交换法提取柠檬酸。

图11-26 钙盐法提取柠檬酸工艺流程

钙盐法的基本过程：发酵液首先经过加热处理后，采用过滤或超滤除去菌体等不溶性残渣，然后在澄清过滤液中加入碳酸钙或石灰乳进行中和，使柠檬酸以柠檬酸钙形式沉淀下来，通过过滤（或离心）将它与可溶性的糖、蛋白、氨基酸、其他有机酸、无机离子等杂质分离开，中和工艺流程如图11-27和图11-28所示。柠檬酸钙用热水反复洗涤后再经硫酸酸解，生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，硫酸钙沉淀被滤除，最后获得粗柠檬酸液（酸解液）。中和和酸解反应分别为：

中和：2C₆ H₈O₇·H₂O+3CaCO₃→Ca₃（C₆ H₅O₇）₂·4H₂O+3CO₂↑+H₂O；

酸解：Ca₃（C₆ H₅O₇）₂·4H₂O+3H₂ SO₄+4H₂O→2C₆ H₈O₇·H₂O+3CaSO₄·2H₂O

粗柠檬酸液通过脱色和离子交换进一步净化，净化后的柠檬酸溶液再经浓缩、结晶、离心得到柠檬酸晶体，干燥和检验后包装出厂。

图11-27 中和工艺流程

（二）柠檬酸生产工艺

柠檬酸发酵生产过程包括菌种制备、淀粉质原料液化、发酵以及提取几个阶段。现就某发酵企业的柠檬酸工业化生产工艺进行简要介绍。

1. 菌种制备

（1）摇瓶培养基制备称取250g玉米粉，加水定容至1000mL，加α-淀粉酶2g。于水浴锅中，60℃左右保温1h，再升温至100℃，用碘液检测无淀粉反应，即液化完全，留取10%液化液即100mL，其余用滤布除渣，滤液定容至1000mL，即得玉米粉液化液培养基。按50mL/瓶的量装入250mL三角瓶内，灭菌备用。

图11-28 连续中和工艺流程

（2）分离筛选 通过平板分离获得的黑曲霉单菌落接入摇瓶培养基中，摇瓶培养48h，镜检、测酸，要求菌球大小一致，菌丝健壮、无杂菌、有小梗、酸度正常；96h酸度正常。初筛较好的菌种经过复筛，挑选出产酸最高的一株保藏在小试管中备用。

（3）大试管培养 用4°Bé麦芽汁制备大试管固体斜面，然后接入经过复筛的小试管菌株孢子，培养室内培养。同一批号随机抽取1/3，进行摇瓶培养，48h下摇瓶产酸正常，镜检无杂菌，证明此批大试管合格，可用于制作麸曲。

（4）麸曲培养 取大片麸皮，用水将淀粉冲洗干净，甩去多余水分，麸皮含水量调至55%～65%左右，将55～60g麸皮装入1000mL三角瓶中，塞好棉塞，灭菌冷却。将菌种接入麸曲三角瓶中，至麸曲培养间进行麸曲培养。

为保证种子罐的种子培养质量，需对每一批麸曲菌种进行随机抽查，只有抽查合格的麸曲才可用于制作孢子悬浮液。方法：取培养成熟的麸曲，每8瓶为一组，在酒精火焰下每瓶麸曲用接种针蘸取少许放入同一个装有玉米粉培养基的三角瓶中，（34±1）℃条件下摇瓶培养24h，镜检观察，生长状况良好、无染菌污染、菌丝正常的麸曲方可用于生产。

（5）孢子悬液制备 在酒精火焰下，按一瓶无菌水稀释三瓶麸曲的标准，将无菌水倒入麸曲瓶内，摇匀。在接种钢瓶口周围放上酒精棉球，拧紧瓶盖只剩一丝，点燃棉球的同时，迅速拿去瓶盖。将孢子悬液倒入接种钢瓶中。接完后，用镊子夹去棉球，盖紧瓶盖贴上接种日期，菌种批号。(www.xing528.com)

2. 淀粉质原料液化

（1）调浆 除杂后的玉米经粉碎后打入调浆罐，依进入调浆罐内玉米粉量调节加水量，粉浆浓度要大于液化配料定容浓度且符合相关工艺规定。调浆完毕，向罐内加入一定量的耐高温α-淀粉酶，用量一般为每吨玉米粉添加0.5～1.8kg耐高温α-淀粉酶。加水定容至规定体积，然后加Ca（OH）₂调节pH。

（2）液化 虽然柠檬酸生产菌黑曲霉能产生和分泌淀粉酶和糖化酶，但是为了缩短发酵时间，对于各种淀粉以及薯干、木薯、玉米粉粉碎后的原料都需预先进行液化，目前柠檬酸发酵生产均采用酶法进行液化。料液通过喷射液化器进满承压罐后进入层流罐，承压罐、层流罐受压≤0.2MPa。一次液化温度80～85℃，当料液进至最后一个层流罐时，打开维持罐进料阀，进行二次液化。二次液化温度90～95℃。

液化料液合格后，板框压滤机进料压滤。

3. 发酵

（1）种子罐接种 种子罐容积50m³，种子罐中先打入玉米液化液（总糖约15%），另加营养盐适量，定容为种子罐总体积65%～70%。培养基用0.1MPa蒸汽灭菌30min，当罐温降至38℃时（冬季39～40℃），准备接麸曲。保持罐内正压，用火焰保护法将钢瓶内的孢子液接入种子罐，要不停摇晃钢瓶直至液体接完，然后关闭小排气和接种阀，将进风阀打开1圈，罐压控制不低于0.05MPa，运转18h后进风阀全开，上罐结束。

（2）种子培养 种子罐接麸曲温度38℃（指标范围为36～40℃，根据实际环境温度进行调整），接种pH2.5（该控制指标为目标值，指标范围为≤3.5）。培养温度36℃（该控制指标为目标值，指标为33～36.5℃），罐压控制在0.05～0.1MPa，搅拌转速90～150r/min，通风比0.12～0.15/min。种龄30h（根据实际生长情况进行调整）。培养过程中采取镜检手段对种子罐生长情况进行监控。其例行镜检为菌种生长的6～14h内，每2h一次，18h后每6h一次，接种前取样。如遇特殊情况适当添加镜检次数。

（3）发酵罐接种 发酵罐容积300m³，发酵罐中打进液化液底料，然后添加辅料，尿素、氢氧化钙等，发酵罐消罐结束后，当罐温降至60～65℃时，将一定量的糖化酶接入发酵罐，并在此温度下保温30min～1h。当罐温降至38～39℃时接种，首先关闭种子罐接种分配箱上的所有小排气，接着关闭种子罐底蒸汽阀和管道上所有小排气，给出接种信号，接种10min后停种子罐搅拌，接种完毕。

（4）发酵罐培养 发酵罐培养温度37℃。罐压控制在0.05～0.1MPa，搅拌转速90～150r/min，通风比0.12～0.15/min。培养过程中采取镜检手段对种子罐生长情况进行监控。其例行镜检为菌种生长的16h内每4h一次，16h后每8h一次，接种前取样。产酸停止，还原糖达到0，达到放罐条件。

4. 提取

（1）发酵液预处理 成熟的发酵液用蒸汽加热至100℃后再放罐。加热的作用是终止发酵，使蛋白质变性凝固，易于过滤，使菌丝受热破裂，彻底释放菌体内的柠檬酸。发酵液经压滤后，即为清液。若清液浊度＞25NTU，清液菌丝体＞10个/50mL，需增加二次过滤。剩余的固形物成为酸渣。用水将酸渣中残余柠檬酸分离出来而得到的低浓度柠檬酸溶液，称为稀酸。

（2）中和 将CaCO₃和Ca（OH）₂分别调浆，浓度均为60%（质量分数）。

向中和桶内注入一定量母液（来自后道结晶工序，即柠檬酸结晶体分离后残余的柠檬酸饱和溶液）和清液，并打入适量的稀酸，使混合液酸度达到110～120g/L要求，搅拌物料，混合均匀，加热至70℃。然后加入CaCO₃并逐步加大钙流量，时间不宜超过45min，以免时间偏长影响柠檬酸钙颗粒的形成，可适当加入少量消泡剂消沫。当pH达到4.4时停止加钙，通入少量蒸汽（通蒸汽3min），搅拌5～10min使中和反应充分，取样测定残酸在0.1%～0.2%之间即达到终点。

走进企业 母液、清液和稀酸

母液：指离心机把柠檬酸结晶体甩干后，甩出来的未结晶的柠檬酸浓缩液。用无离子水喷洗柠檬酸结晶体表面杂质后，被甩出来后，一并也叫母液。母液的柠檬酸浓度高，一般在700g/L以上。

清液：指经过过滤的柠檬酸发酵液，一般在120～150g/L左右。

稀酸：柠檬酸发酵液过滤后的固体就是柠檬酸酸渣（饼状物，俗称滤饼），酸渣里含有柠檬酸，用自来水顶进滤饼，将残存的柠檬酸洗出来，一次不行，再洗一次，最后用空气顶吹。直到滤饼中的柠檬酸含量在0.5%以下。此时，洗水中柠檬酸含量大概在5%～8%左右。因为浓度低于清液，所以俗称稀酸。

中和时加清液的同时，还加入了母液和稀酸，是为了提高收率，同时做到废物利用，而且浓度一大一小，调配后酸度正好，这是行业内的通用做法。

用Ca（OH）₂调终点时，前期加CaCO₃操作同前，当pH达到4.1时停止加Ca-CO₃，通入少量蒸汽，控制时间3min，使物料充分反应，然后加入Ca（OH）₂，调pH至4.6～5.0即合格。物料沉降30min后，取样观察，确认柠檬酸钙完全沉降。真空抽滤并洗水，确保柠檬酸钙含水量50%以下。

（3）酸解 经中和并洗净的柠檬酸钙不宜贮放过久，应迅速进行酸解。酸解采用质量分数为98%的浓硫酸。酸解时，先把柠檬酸钙用水调成糊状，加热至85℃，缓慢加入适量的硫酸（通过搅拌和物料的酸解反应，溶液中硫酸质量分数保持在5%～8%）。理论上加入硫酸的质量为碳酸钙质量的98%，因为中和时生成少量可溶性杂酸的钙盐，以及过滤洗涤时有少量柠檬酸钙的损失，实际硫酸加入量是碳酸钙用量的92%～95%为宜。酸解做料温度始终控制在70～95℃。

酸解过程在反应釜中进行，直至酸解反应釜内物料达到双清。值得注意的是操作人员要穿戴好劳动保护用品（防酸服、防护眼镜、面罩及手套），每个环节不得违章操作，应小心谨慎、集中精力。酸解反应釜如图11-29所示，酸解终点，煮沸30～45min，然后板框压滤。

图11-29 柠檬酸酸解反应釜

（4）脱色 酸解达终点后，可加入活性炭脱色，或用树脂脱色。活性炭用量一般为柠檬酸量的1%～3%，35℃保温30～35min，即可采用真空抽滤或离心分离；采用树脂脱色时，先滤去硫酸钙沉淀，再将清液通过树脂柱脱色。脱色液透光率≥95%。

（5）离子交换 在柠檬酸酸解液中，混有发酵和提取过程中带入的大量杂质。如Ca²⁺、Fe³⁺、Cl^-等离子，影响产品质量，多采用离子交换树脂去除这些金属离子和阴离子。及时检测稀酸浓度和透光率检测，直至交换液透光率≥95%，Fe³⁺＜5mg/kg，Cl^-＜5mg/kg。

（6）浓缩与结晶 浓缩在一、二、三效蒸发器中进行。浓缩过程中，保证一效温度≤105℃，一效真空度-10～5kPa；二效温度70～90℃，二效真空度-30～-75kPa；三效温度55～80℃，三效真空度≥-85.5kPa。

浓缩料液在结晶锅内进行。打料前期、中期抽样测相对密度，接料（60℃）波美度应在1.340～1.345。浓缩液温度需控制在48～65℃，降温速度（前期）控制在（10±5）℃/h，起晶结束后，以下降3℃/h为标准。

经离心后得到的湿晶体（水分≤0.8%）进入烘干机烘干，然后进行包装，成品包装间温度控制在10～25℃，相对湿度≤87%。