酵母细胞的包埋固定和培养技巧优化

一、任务目标

（1）理解包埋固定化细胞的原理和方法。

（2）掌握用海藻酸钠固定化酵母细胞的制备及培养方法。

二、操作原理

选用海藻酸钠和氯化钙制成的海藻酸钙凝胶包埋酵母生长细胞。固定化酵母细胞的培养在酒精发酵瓶中进行，如图10-18所示。

图10-18 酒精发酵装置

三、材料器具

1. 材料

（1）2%海藻酸钠溶液10mL，加热助溶，灭菌后，冷却至45℃备用。

（2）100mL 2%氯化钙溶液，灭菌冷却后备用。

（3）市售活性干酵母，无菌蒸馏水。

2. 主要仪器设备

20mL注射器，烧杯，玻璃棒，三角瓶，酒精发酵装置。

四、任务实施

1. 酵母细胞的活化

取市售干酵母按1∶20的比例投放于36～38℃的温水中活化15～20min，酵母细胞活化时体积会变大，活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。

2. 海藻酸钠溶液及交联剂的制备

称取3g海藻酸钠，用100mL烧杯装有50mL蒸馏水边加热边搅拌溶胀15min，直至完全溶化，用无菌水定容至50mL，封口灭菌。加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。

配制2%浓度的氯化钙溶液100mL，加入稀盐酸调节溶液至适合酵母生长的pH 3.8～6.0。装入200mL烧杯中，封口灭菌，冷却后备用。(www.xing528.com)

3. 酵母细胞的固定化

在冷却至45℃左右海藻酸钠溶液中，加入5mL预热至35℃活化的酵母培养液，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中。用注射器以缓慢而恒定的速度将其滴入氯化钙溶液中，边滴边摇动三角瓶，即可制得直径为2～3mm左右的凝胶珠。凝胶珠在氯化钙溶液中钙化30min，即可使用。以上操作均应在超净工作台上进行，按照无菌操作要求操作以免影响实验结果。

4. 发酵培养

把制得的固定化酵母细胞，移入生理盐水或无菌水中，洗涤2次，然后把固定化小球全部转移到发酵培养基中（10%的葡萄糖液）20mL中，28℃，静止培养一周后测乙醇含量。将发酵后的固定化酵母细胞用生理盐水洗1次，就可以再接入新的发酵培养基，进行第2次发酵。

5. 观察和测定

（1）培养前，揩干三角瓶外壁，置于天平上称量，记下质量为m₁；培养完毕后，取出三角瓶轻轻摇动，使二氧化碳尽量逸出，在同一架天平上称重，记下质量为m₂ ，二氧化碳质量=m₁-m₂。

（2）打开三角瓶，嗅闻有无酒精气味，从三角瓶中取出发酵液5mL，注入空试管中，再加10%硫酸溶液2mL；向试管中滴加1%重铬酸钾溶液10～20滴，如管内由橙黄色变为黄绿色，则证明有酒精生成（注：用纯酒精加水做对比试验，该现象并不明显）。

五、结果处理

六、注意事项

（1）加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，涉及到任务的成败。

（2）刚形成的凝胶珠应在氯化钙溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，具体方法：一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不易破裂，无液体流出，就表明凝胶珠合格；二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，若凝胶珠易弹起，也能表明制备的凝胶珠是合格的。

（3）如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。

七、任务考核

（1）海藻酸钠溶解充分，溶液均一。（10分）

（2）固定化处理过程顺序完整、操作正确。（40分）

（3）固定化所得颗粒均匀、成珠状，没有或少有蝌蚪状或条状。（30分）

（4）准确计算二氧化碳的释放量。（20分）