壳聚糖絮凝法：高效沉淀微生物菌体

一、任务目标

（1）加深理解发酵液中固液分离的预处理方法。

（2）理解和掌握絮凝法的原理及分离操作过程。

二、操作原理

壳聚糖是甲壳素经化学法脱乙酰基后的产物，是至今发现的唯一天然碱性多糖。壳聚糖分子链上分布着大量游离羟基和氨基，尤其在一些稀酸溶液中易质子化，从而使壳聚糖分子链上带有大量的正电荷，成为一种可溶性聚电解质，具有阳离子型絮凝剂的作用。壳聚糖安全无毒，可生物降解，环境友好，因而成为絮凝、回收菌体和蛋白质的理想絮凝剂。

壳聚糖絮凝法沉淀微生物菌体的过程复杂，其主要沉降原理是壳聚糖与带电的悬浮颗粒通过分子间的架桥、氢键及电荷吸附等作用形成粗大的絮凝团，最终沉降下来。pH是影响菌悬液絮凝分离结果的重要因素，只有在酸性环境中，壳聚糖分子链中的-NH₂与H⁺结合形成-NH₃⁺，具有电中和与吸附交联的双重作用。

三、材料器具

1. 材料

（1）药品及试剂

壳聚糖，海藻酸钠，1%的氢氧化钠溶液，1%乙酸溶液，6mol/L的盐酸。

（2）菌种及其培养基

枯草芽孢杆菌，酵母菌，营养肉汤培养基，YP D酵母培养基。

2. 主要仪器设备

酸度计，分光光度计，电子天平，大试管，吸管等。

四、任务实施

1. 发酵液的制备

枯草芽孢杆菌用肉汤培养基培养，酵母菌用YP D酵母培养基培养，发酵至稳定期得到菌悬液。

2. 絮凝剂和助凝剂的配制(www.xing528.com)

壳聚糖预先溶于1%乙酸溶液中，终浓度为10g/L。海藻酸钠预先溶于1%的氢氧化钠溶液中，终浓度为10g/L。

3. 不同pH的菌悬液配制

将发酵的菌悬液混匀，并在600nm下测定其吸光度（A₁），分别取发酵液20mL置于50mL离心管中，用6mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调pH分别为3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0。

4. 絮凝沉淀

向不同pH的发酵液中加入0.6mL的海藻酸钠溶液（终浓度约为0.3g/L），并迅速混匀，再向发酵液中加入1mL壳聚糖溶液（终浓度约为0.5g/L），振荡5min后在室温下静置40min，取上清液在600nm下测定其吸光度（A₂ ）。

5. 絮凝率的计算

计算公式：

式中 A₁——絮凝前菌悬液在600nm波长下的吸光度；

A₂——絮凝后上清液在600nm波长下的吸光度。

五、结果处理

（1）分别测定不同pH条件下微生物菌体的絮凝率，并作出不同pH对两种发酵液絮凝率影响的效果图。

（2）确定壳聚糖对发酵液絮凝的最适pH。

六、任务考核

（1）絮凝率的计算无差错。（20分）

（2）正确绘制不同pH对两种发酵液絮凝率影响的效果图。（20分）

（3）絮凝操作准确。（30分）

（4）确定壳聚糖对发酵液絮凝的最适pH。（30分）