一、任务目标
（1）加深对培养方法的认识，了解补料分批培养过程控制方法。
（2）熟悉和掌握发酵过程相关参数的测定。
二、操作原理
用黏红酵母生产类胡萝卜素具有较大的应用价值和研发前景，且研究提高黏红酵母的产量并获取高的类胡萝卜素收率更具有实际意义。黏红酵母的发酵全过程分为三个阶段：调整期（0～12h）、对数期（12～48h）和平衡期（48～72h），而类胡萝卜素的形成主要集中在黏红酵母生长对数期的后期，类胡萝卜素是次级代谢，它的形成和菌体生长无关，但菌体量的多少又直接影响到类胡萝卜素的总收率。
三、材料器具
1. 材料
（1）菌种黏红酵母。
（2）斜面培养基PDA培养基。
（3）种子培养基（g/L）：葡萄糖30.0，酵母浸粉5.0，KH2PO42.0，Na2HPO4 1.0，MgSO4 2.0，调pH5.0。
（4）发酵培养基（g/L）：葡萄糖50.0，酵母浸粉5.0，KH2PO46.0，Na2HPO4 1.0，MgSO4 5.0，调pH6.0。
（5）流加培养基流加的浓葡萄糖液质量浓度为250g/L。
2. 主要仪器设备
5L发酵罐，三角瓶。
四、任务实施
1. 流加培养前的准备工作
在培养罐中加入去离子水，将温度传感器、空气过滤器安装好，用橡胶管连接好取样口、流加液入口，不需要的接口全部封好。橡胶管用弹簧夹夹住，排气口用一小段棉花塞好。确认所有连接无问题后，打开通风排气系统，检查是否有漏气、阻塞现象（轻轻堵住排气口，看其他地方是否漏气），确认正常。
2. 种子培养
自斜面菌种挑起2环黏红酵母菌体，接入装有50mL培养基的250mL三角瓶中，摇匀后，置于摇床上在24℃、200r/min条件下培养48h。将上述培养好的液体种子接入装有100mL液体培养基（灭过菌的）的1L的三角瓶中，接种量10%，在24℃、200r/min条件下培养48h。
3. 灭菌
发酵罐中加入已调配好的培养基后，放在灭菌锅中121℃下，灭菌20～30min，流加葡萄糖应同时灭菌。发酵罐取出后，开通冷却水进行冷却，同时开动搅拌器，通入无菌空气以防产生负压，冷却到发酵温度25℃。
4. 系统安装(www.xing528.com)
利用硅胶管将250g/L葡萄糖液贮瓶连接蠕动泵和发酵罐入口，将贮瓶上的排气口塞上棉花用弹簧夹夹住。如果传感器不能用蒸汽灭菌，可以在室温下把传感器在75%酒精中浸泡15min进行灭菌，然后用无菌水洗净，尽快安装在发酵罐上。
5. 流加培养
采用火焰保护接种，接种量10%，在通风比0.2/min、搅拌转速300r/min、22℃下进行培养。流加限制性基质为葡萄糖，采样量为5～10mL，用葡萄糖分析仪测定葡萄糖浓度。当培养至培养基葡萄糖浓度低于5g/L（约60h时），开动蠕动泵流加250g/L的葡萄糖溶液200mL，使罐内葡萄糖浓度达到20～30g/L。流加培养8h后再次补加250g/L的葡萄糖溶液200mL，每隔8h取样（自第一次流加后取样3次），测定培养液中葡萄糖含量、菌体生物量和类胡萝卜素含量。流加培养至24h结束，将培养液进行蒸汽灭菌后弃去，清洗发酵罐。
五、结果分析
1. 黏红酵母生物量（菌体干重）的测定
先称取空离心管质量，记为m1 ，取5mL发酵液置于离心管中，5000r/min离心5min，上清液保存于冰箱中，之后进行生物量的测定，菌体和离心管一起于105℃烘干至恒重后称取离心管和菌体的质量，记为m2 ，根据下式计算不同时间菌体的生物量。
生物量（g/L） =200×（m2-m1 ）
2. 葡萄糖含量的测定
用蒸馏水将所得样品上清液中的葡萄糖浓度稀释至2g/L以下，用0.45μm的微孔膜过滤以后用葡萄糖分析仪进行测定。
3. 类胡萝卜素含量的测定
取5mL发酵液以6000r/min离心8min，用蒸馏水洗涤、离心3次后，弃去上清液，然后在离心管中加入二甲基亚砜（DMSO）3mL，用玻璃棒搅拌至菌体溶解，6000r/min离心8min，收集上清液于试管中，离心管中再次加入二甲基亚砜3mL，用玻璃棒搅拌至菌体溶解，6000r/min离心8min，合并提取液，如此多次提取至菌体无色。离心提取液用分光光度计于480nm波长下测定吸光度，并计算总的类胡萝卜素含量。类胡萝卜素含量计算公式：
类胡萝卜素含量（g/L） =1.25×Vf ×A480nm
式中 Vf——提取液体积；
A480nm——类胡萝卜素480nm波长处的吸光度。
4. 变化曲线图
画出培养液中葡萄糖含量、菌体生物量和类胡萝卜素含量随发酵及流加培养时间的变化曲线图。
六、任务考核
（1）准备工作充分。（10分）
（2）种子培养和接种操作熟练、正确。（20分）
（3）流加培养过程完整，操作熟练。（30分）
（4）相关参数测量或计算方法可靠，结果准确。（40分）
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