基质对发酵及补料控制的影响

基质即培养微生物的营养物质。采用补料控制工艺，可补加的物料包括：补充菌体需要的碳源和氮源，补充微量元素或无机盐。

（一）碳源对发酵的影响及控制

1. 碳源种类

快速利用的碳源有葡萄糖、蔗糖等，能迅速参与菌体繁殖、释放能量和代谢合成，并产生分解产物，但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用。缓慢利用的碳源，多数为聚合物、淀粉等，为菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于延长抗生素的分泌期。

青霉素发酵中，在迅速利用的葡萄糖培养基中，菌体生长良好，但青霉素合成量很少；相反，在缓慢利用的乳糖培养基中，青霉素的产量明显增加。缓慢滴加葡萄糖以代替乳糖，仍然可以得到良好的结果。因此，糖的缓慢利用是青霉素合成的关键因素。糖对青霉素生物合成的影响如图8-24所示。

图8-24 糖对青霉素生物合成的影响曲线

因此，要合理使用迅速利用的碳源，在工业上，发酵培养基中常采用含迅速利用和缓慢利用的混合碳源。

2. 碳源浓度

营养过于丰富对菌体的代谢、产物的合成及氧的传递都会产生不良的影响。若产生阻遏作用的迅速利用的碳源用量过大，则产物的合成会受到明显的抑制；反之，仅仅供给维持量的碳源，菌体生长和产物合成就都停止。例如，黑曲霉柠檬酸发酵，在蔗糖浓度15%～18%时，蔗糖同化率97%；蔗糖浓度为20%时，只同化92%；蔗糖浓度低于10%，产柠檬酸少，积累草酸；蔗糖浓度低于2.5%，不产柠檬酸。

3. 补糖控制

补糖方式可以采用连续流加，也可以采用少量多次间歇补入或大量少次补入等方式。碳源的浓度优化控制可以采用经验法，根据不同代谢类型来确定补糖时间、补糖量和补糖方式；也可以采用动力学法，根据菌体的比生长速率、糖比消耗速率及产物的比生成速率等动力学参数来控制。

在某一浓度下碳源会阻遏一个或更多的负责产物合成的酶，这称之为碳分解代谢物阻遏。头孢菌素C生物合成途径中的关键酶去乙氧头孢菌素C合成酶对碳分解代谢阻遏物很敏感，葡萄糖还阻遏头孢菌素C生物合成中的另一关键酶δ-（α-氨基己二酰胺）-半胱氨酰-缬氨酸合成酶。避免分解代谢物阻遏的一种办法是使补入碳源的速率等于其消耗的速率，另一种办法是使用非阻遏性碳源，如除葡萄糖以外的其他单糖、寡糖、多糖或油等。

补糖量要与消耗平衡，维持稳定的糖浓度，补糖时机很重要。谷氨酸追加糖液发酵，当菌体处在生长对数期后进入产酸期，糖浓度在2%左右时，连续流加糖液，维持2%左右的糖浓度；发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。

补糖时机过早，刺激生长，加速糖利用；过迟，所需能量跟不上。以四环素发酵中补加葡萄糖为例，如图8-25所示为3个不同时间加糖的效果。第Ⅰ种补料时机适当（在接种45h后加），发酵96h单位在10000μg/mL以上；第Ⅱ种加糖时间过晚（接种后62h开始加）；第Ⅲ种加糖时间过早（接种后20h后加），其发酵96h的单位与不加糖的对照组相近，为6000μg/mL左右，并没有显示补糖的重要性。(www.xing528.com)

图8-25 加糖时间对四环素发酵单位的影响

Ⅰ. 加糖时间适当； Ⅱ加糖时间过晚； Ⅲ加糖时间过早

判断补糖时机不能单纯以培养时间作为依据，还要根据基础培养基中碳源的种类、用量和消耗速度、前期发酵条件、菌种特性、种子质量等因素判断，因此根据代谢变化，如残糖含量、pH或菌体形态等来考虑，比较切合实际。

（二）氮源对发酵的影响及控制

氮源主要影响产物合成的方向和产量，如谷氨酸发酵，NH₄⁺供应不足，促使形成α-酮戊二酸；NH₄⁺过量，促使谷氨酸转变成谷氨酰胺。因此，控制适量的NH₄⁺浓度，才能使谷氨酸产量达到最大。

快速利用的氮源，如氨基酸、铵盐、氨水及玉米浆等，容易被菌体利用，促进菌体生长，但对某些代谢产物的合成，特别是某些抗生素的合成产生调节作用，影响产量。如链霉菌的竹桃霉素发酵中，采用促进菌体生长的铵盐浓度，能刺激菌丝生长，但抗生素产量下降。铵盐还对柱晶白霉素、螺旋霉素、泰洛星等的合成产生调节作用。

缓慢利用的氮源，如酵母粉（膏）、黄豆饼粉、尿素等，能延长代谢产物的分泌期、提高产物的产量。但一次投入也容易促进菌体生长和养分过早耗尽，以致菌体过早衰老而自溶，缩短产物的分泌期。为此，可通过补料的方式来解决，例如，青霉素发酵，后期出现糖利用缓慢、菌体浓度变稀、菌丝展不开、pH下降的现象，补加尿素溶液可改善这种状况并提高发酵单位。

发酵培养基一般选用含有快速利用和缓慢利用的混合氮源，如，氨基酸发酵用铵盐（硫酸铵或醋酸铵）和麸皮水解液、玉米浆。链霉素发酵采用硫酸铵和黄豆饼粉。除了基础培养基中的氮源外，往往还需要在发酵过程中补加氮源来控制浓度，调节pH。

（三）磷酸盐对发酵的影响及控制

磷是构成蛋白质、核酸和ATP的必要元素，是微生物菌体生长繁殖和合成代谢产物所必需的。在发酵过程中，微生物从培养基中摄取的磷一般以磷酸盐的形式存在。因此，在发酵工业中，磷酸盐的浓度对菌体的生长和产物的合成有一定的影响。

磷酸盐浓度的控制，一般是在基础培养基中采用适当的浓度。发酵所需磷的适当浓度取决于菌种特性、培养条件、培养基组成和来源等因素，还要结合当地的具体条件和使用的原材料进行实验确定。如四环素发酵，菌体生长最适的磷浓度为65～70μg/mL，而四环素合成最适磷浓度为25～30μg/mL。青霉素发酵，0.01%的磷酸二氢钾为好。一般来说，微生物生长良好所允许的磷酸盐浓度为0.32～300mmol/L，次级代谢产物合成良好所允许的最高平均浓度仅为1.0mmol/L。

除上述主要基质外，还有其他培养基成分（如某些金属离子）影响发酵。例如，在以醋酸为碳源的培养基中，Cu²⁺能促进谷氨酸产量的提高。Mn²⁺对芽孢杆菌合成杆菌肽等次级代谢产物具有特殊的作用，必须使用其足够的浓度才能促进杆菌肽的合成等。

总之，发酵过程中，控制基质的种类及其用量是发酵能否成功的关键，必须根据产生菌的特性和各个产物合成的要求，进行深入细致的研究，方能取得良好的结果。