在通风发酵中，必须连续通入无菌空气，氧由气相溶解到液相，然后经过液流传给细胞壁进入细胞体内，以维持菌体的生长代谢和产物合成。因此发酵液中溶氧的大小对菌体的代谢特性有直接影响，是发酵过程控制的一个重要参数。在发酵过程中连续测定发酵液中溶氧浓度的变化，可随时掌握发酵过程的供氧、耗氧情况，为准确判断设备的通气效果提供可靠数据，以便有效控制发酵过程，为实现发酵过程的自动化控制创造条件。
（一）溶氧对发酵的影响
大多数发酵过程是好氧的，因此需要供氧。许多发酵的生产能力受到氧利用限制，因此氧成为影响发酵效率的重要因素。
1. 发酵过程中氧的需求
在发酵过程中，微生物只能利用溶解状态下的氧。好气性微生物深层培养时需要适量的溶氧以维持其呼吸代谢和某些代谢产物的合成。不同种类的微生物的需氧量不同，一般为25～100mmolO2/（L·h）。同一种微生物的需氧量，随菌龄和培养条件不同而异。
氧是一种难溶气体，在25℃、0.1MPa下，空气中的氧在水中的溶解度为0.25mmol/L，在发酵液中的溶解度只有0.22mmol/L，而发酵液中的大量微生物耗氧迅速 [耗氧速率大于25～100mmol/（L·h ）]。因此，在好氧深层培养中，氧气的供应往往是发酵过程能否成功的重要限制因素之一。如果外界不能及时供给氧，这些溶氧只能维持微生物菌体15～20s的正常呼吸，随之就会被耗尽，微生物的呼吸就会受到抑制。呼吸强度与溶氧的关系如图8-12所示。在发酵过程中，微生物只能利用溶解状态下的氧，因此，就必须采取强化供氧。在实验室和小规模发酵培养过程中，可以通过摇瓶机的往复运动或偏心旋转运动对摇瓶中的微生物供氧；对大规模生产的发酵罐供氧采用通入无菌空气的方式。
图8-12 呼吸强度与溶氧的关系
在培养过程中不需要使溶氧浓度达到或接近饱和值，而只要超过某一临界溶氧浓度即可。所谓临界溶氧浓度就是当培养基不存在其他限制性时，能满足微生物呼吸的发酵液中最低溶氧浓度，用Ccr表示。某些微生物的临界氧浓度如表8-10所示。在临界溶氧浓度以下，微生物的呼吸速率随溶解氧浓度降低而显著下降，好氧微生物临界氧浓度大约是饱和浓度的1%～25%。据报道，次级代谢产物青霉素发酵的临界氧浓度为5%～10%，低于此值就会给青霉素合成带来损失，时间越长，损失越大。因此，在发酵过程中，只有使溶氧浓度高于其临界值，才能维持菌体的最大比摄氧率，得到最大的产物合成量，如果溶氧浓度低于临界值，则菌体代谢可能会受到干扰。
表8-10 某些微生物的临界氧浓度
2. 溶氧对发酵的影响
发酵工业的目标主要是得到菌体发酵的产物而不是菌体本身。溶氧的大小对菌体生长、产物的形成及产量都会产生不同的影响。如谷氨酸发酵，供氧不足时，谷氨酸积累就会明显降低，产生大量乳酸和琥珀酸。又如薛氏丙酸菌发酵生产维生素B12中，维生素B12的组成部分咕啉醇酰胺（又称B因子）的生物合成前期的两种主要酶就受到氧的阻遏，限制氧的供给，才能积累大量的B因子，B因子又在供氧的条件下才转变成维生素B12，因而采用厌氧和供氧相结合的方法，有利于维生素B12的合成。对抗生素发酵来说，氧的供给就更为重要。如金霉素发酵，在生长期短时间停止通风，就可能影响菌体在生产期的糖代谢途径，由HMP途径转向EMP途径，使金霉素产量减少。金霉素C6上的氧还直接来源于溶氧，所以溶氧对菌体代谢和产物合成都有影响。
初级代谢的氨基酸发酵，需氧量的大小与氨基酸的合成途径密切相关。根据发酵需氧要求不同可分为三类：第一类有谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和脯氨酸等谷氨酸系氨基酸，它们在菌体呼吸充足的条件下，产量才最大，如果供氧不足，氨基酸合成就会受到强烈的抑制，大量积累乳酸和琥珀酸；第二类，包括异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸和天冬氨酸，即天冬氨酸系氨基酸，供氧充足可得最高产量，但供氧受限，产量受影响并不明显；第三类，有亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，仅在供氧受限、细胞呼吸受抑制时，才能获得最大量的氨基酸，如果供氧充足，产物的形成反而受到抑制。
氨基酸合成的需氧程度产生这些差别的原因，是由它们的生物合成途径不同所引起的，不同的代谢途径产生不同数量的NAD（P ）H，当然再氧化所需要的溶氧量也不同。由此可知，供氧大小是与产物的生物合成途径有关。
综上所述，好氧发酵并不是溶氧愈大愈好，溶氧太大有时反而抑制产物的形成。为此，就需要由实验来确定每一种发酵产物的临界氧浓度和最适溶氧浓度，并使发酵过程保持在最适溶氧浓度。
（二）发酵过程中溶氧的变化及异常现象
1. 发酵过程中溶氧变化规律
在确定的设备和发酵条件下，每种微生物发酵的溶氧浓度变化都有一定的规律。一般说来，在分批发酵过程中，溶氧变化的规律：在无溶氧控制情况下，溶氧浓度的变化呈现 “波谷现象”。如图8-13和图8-14所示。
图8-13 谷氨酸发酵时正常和异常溶氧曲线
发酵初期，即停滞期和对数生长期，菌体大量繁殖，氧气消耗大，此时需氧超过供氧，溶氧明显下降，出现一个低谷（如谷氨酸发酵的溶氧低谷在发酵后10～20h，抗生素在发酵后10～70h），对应地，菌体的摄氧率同时出现一个高峰，随着发酵液中菌体浓度的不断上升，黏度一般在这个时期也会出现一高峰阶段，说明生产菌此时正处在对数生长期。溶氧曲线中低谷出现的时间和低谷的溶氧浓度随菌种、工艺条件和设备供氧能力不同而异。
图8-14 红霉素发酵时溶氧和黏度的变化曲线
过了生长阶段，进入产物合成期，需氧量有所减少，这个阶段的溶氧水平相对比较稳定，但受补料、加油等工艺控制手段的影响较大。如补糖，则摄氧率增加，溶氧浓度下降，经过一段时间后又逐步回升，若继续补糖，溶氧浓度甚至会降到临界氧浓度以下，而成为生产的限制因素。
发酵后期由于菌体衰老和大量死亡，呼吸强度减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧浓度就会明显地上升。
2. 溶氧的异常现象
在发酵过程中，有时出现溶氧明显降低或明显升高的异常变化，常见的是溶氧下降。引起溶氧异常下降原因可能有：①污染好气性杂菌，大量的溶氧被消耗掉，可能使溶氧在较短时间内下降到零附近，跌零后长时间不回升；②菌体代谢发生异常现象，需氧增加，溶氧下降；③某些设备或工艺控制发生故障或变化，搅拌功率变小或搅拌速度变慢，影响供氧能力，使溶氧降低；④消泡剂因自动加油器失灵或人为加量太多，也会引起溶氧迅速下降。
引起溶氧异常升高的原因：在供氧条件没有发生变化的情况下，主要是耗氧出现改变，如菌体代谢出现异常，耗氧能力下降，使溶氧上升；特别是污染烈性噬菌体，影响最为明显，生产菌尚未裂解前，呼吸已受到抑制，溶氧有可能上升，直到菌体破裂后，完全失去呼吸能力，溶氧就直线上升。
另外，培养菌的正常生长过程也可能会引起溶氧的迅速下降或上升，而且有的产品在培养过程中要人为控制溶氧，比如搅拌转速、空气压力、通气量等都会直接影响溶氧的变化。因此，不能简单地把溶氧变化作为发酵异常的指示。
当然，在其他工艺条件不变的情况下，通过发酵液中溶氧的异常变化曲线与正常溶氧变化曲线的对比，我们能及时了解和分析微生物生长代谢是否正常，工艺控制是否合理，设备供氧能力是否充足等问题，帮助我们查找发酵不正常的原因和控制好发酵生产。
（三）氧的传递
在深层培养中进行通气供氧时，氧气从气泡传递至细胞内，需要克服一系列阻力，首先氧必须从气相溶解于培养基中，然后传递到细胞内的呼吸酶位置上而被利用。氧从气泡到细胞的传递过程如图8-15所示。
图8-15 氧从气泡到细胞的传递过程示意图（氧传质双膜理论）
1～4—供氧的传质阻力 5～9—耗氧方面的传质阻力
由于氧是难溶于水的气体，所以在供氧方面液膜阻力是氧溶于水时的限制因素，若使气泡和液体充分混合而产生湍动可以减少这方面的阻力。在耗氧方面，根据实验表明，液体主流和细胞壁上氧的浓度差很小，说明氧通过细胞周围液膜的阻力是很小的，所以主要阻力来自于菌丝丛内与细胞膜阻力，但搅拌可减少这方面的阻力。
1. 气体溶解过程的双膜理论
在气泡与包围着气泡的液体之间存在着界面，在界面的两旁具有两层稳定的薄膜，即气泡一侧为气膜，液体一侧为液膜。氧气分子以扩散方式，借浓度差而透过双膜。
氧从空气主流扩散到气液界面的推动力是空气中氧的分压力与界面处氧分压之差，即p-pi，氧穿过界面溶于液体，继续扩散到液体中的推动力是界面处氧的浓度与液体中氧浓度之差，即ci-cL。
在气液界面上，气液两相的浓度总是互相平衡（空气中氧的分压与溶于液体中的氧浓度处于平衡状态）。双膜理论的气液接触界面附近氧分压与浓度的变化如图8-16所示。
图8-16 双膜理论的双模及气液接触
2. 氧的传递速率方程
在单位体积培养液中，氧的传递速率计算公式为
OTR=KLa（c∗-cL ）
式中 OTR——单位体积培养液的溶氧速率， mmol/（m3·h）；
a——比表面积（单位体积溶液中所含有的气液接触面积） ， m2/m3；
KL——液膜传递系数， m/s；
KLa——以浓度差为推动力的液相体积溶氧系数， h-1；
c∗——与气相氧分压平衡的液相溶氧饱和浓度， mmol/m3；
cL——液相主体中的溶氧浓度， mmol/m3。(www.xing528.com)
上述公式是从双膜理论推导出的在通气液体中氧传递速率的公式，在氧传递理论中被广泛采用。KLa是反映发酵设备供氧能力的一个重要参数，可以作为一个整体测定。cL有一定的工艺要求，所以可以通过KLa和c∗来调节，调节KLa是最常用的方法。
（四）发酵液中溶氧的控制
发酵液的溶氧浓度，是由供氧和需氧两方面所决定的。因此要控制好发酵液中的溶氧，需从供氧和需氧这两方面着手。
在供氧方面，主要是设法提高氧的传递推动力和氧传递速率常数，因此影响供氧效果的主要因素：空气流量（通风量）、搅拌转速、气体组分中的氧分压、罐压、温度、培养基的物理性质等；影响需氧的则是菌体的生理特性、培养基的丰富程度、温度等。
1. 供氧的控制
控制发酵液中溶氧的手段从供氧方面大致有以下几个方面。
（1）调节通风与搅拌氧传递系数KLa是随通风量的增加而增大的。当增加通风量时，空气的线速度增大，从而增加了溶氧，KLa相应增大。在低通风量的情况下，增大通风量对提高溶氧浓度有十分显著的效果。工业生产中，发酵罐及其配套设备经过设计、加工、安装及运行后，许多影响供氧效果的因素基本固定不变，因此，调节通风量成为好氧发酵中控制溶氧的主要手段。工业发酵过程中，通过调节发酵罐的进气阀门和排气阀门的开度以完成调节通风量的操作，从而满足微生物在不同发酵阶段的需氧量，具体如图8-17所示。
图8-17 调节通风量和搅拌转速示意图
如图8-18所示为国内某企业在360m3发酵罐上一批谷氨酸生产的通风量控制曲线，基本反映谷氨酸发酵过程中通风量控制的一般规律，但即使是同一产品相同的工艺，实际发酵情况仍容易出现波动，其影响因素很多，包括种子质量、接种量、原料来源及发酵过程的各种条件等的差异性，生产中很难采用一个固定的通风量控制模式，需要根据实际耗氧情况进行灵活调节。
图8-18 某厂360m3 发酵罐生产谷氨酸的通风规律
通入发酵罐中的无菌空气的流量常用转子流量计测定。流量计中浮动转子的位置可以通过电容或电阻原理转换为电信号，经过放大之后启动控制器便可实现气体流量控制自动化。转子流量计及原理如图8-19所示。
在通风过程中，当空气流速增大到一定程度，如不改变搅拌转速，则会降低搅拌功率，甚至发生“过载”现象，会使搅拌桨叶不能打散空气，气流形成大气泡在轴的周围逸出，反而使KLa降低。
搅拌转速对KLa值具有很大的影响，对于带有机械搅拌的通风发酵罐，搅拌能把大的空气泡打成微小气泡，增加了接触面积，而且小气泡的上升的速度要比大气泡慢，因此接触时间也增长。搅拌使液体作涡流运动，使气泡做螺旋运动上升，增加了气液的接触时间。搅拌使发酵液呈湍流运动，从而减少了气泡周围液膜的厚度和液膜阻力，因而增大了KLa。搅拌使菌体分散，避免结团，有利于固液传递过程中的接触面积增加，使推动力均一。
图8-19 转子流量计及原理示意
因此，在发酵过程中，调节搅拌转速与通风量协调完成溶氧的控制。由于发酵罐容积越大，氧利用率越高，因而，大型发酵罐可以在较低的搅拌转速和通风比的条件，使供氧和溶氧量达到工艺要求。谷氨酸发酵时不同容积发酵罐的搅拌转速和通风比如表8-11所示。
表8-11 谷氨酸发酵时不同容积发酵罐的搅拌转速和通风比
搅拌转速一般应用磁感应式、光感应式传感器或测速发电机来实现检测。磁感应式传感器结构如图8-20所示。
在通风发酵中，除了用搅拌将空气分散成小气泡外，还可用空气分布管来分散空气。空气分布管的形式、喷口直径及管口与罐底的相对位置都对氧溶解速率有较大的影响。
图8-20 磁感应式传感器结构示意
了解通气搅拌对发酵的影响，最简便有效的办法便是就地测量发酵液中氧的浓度。从氧浓度变化曲线可以看出氧供需的规律及对生产的影响。
（2）改变气体组成中的氧分压用通入纯氧方法来改变空气中氧的含量，提高了c∗值，因而提高了供氧能力。纯氧成本较高，但对于某些发酵需要时，加入纯氧是有效而可行的。黄原胶生产属高需氧量发酵，在发酵过程中需要连续供氧，由于发酵液的黏度大，供氧成为黄原胶发酵的限制性因子，实践发现，在发酵过程中通入纯氧，可以提高约40%的黄原胶产量。
（3）改变罐压 提高氧在溶液中的溶解度最简单的方法是增加罐压。增加罐压实际上就是改变氧的分压来提高c∗，从而提高供氧能力。不过增加罐压是有一定限度的，主要原因：①提高罐压就要相应地增加空压机的出口压力，也就是增加了动力消耗；②整个设备耐压性都要提高；③二氧化碳的分压也相应增加，且由于二氧化碳的溶解度比氧大得多，不利于液相中二氧化碳的排出，还会使培养液的pH发生变化，而影响细胞的生长和产物的代谢。
调节罐压可以通过调节总供气压力、发酵罐的进气阀门以及排气阀门的开度来实现。好氧发酵生产中，罐压一般为0.05～0.1MPa（表压），罐压直接通过安装在罐上的压力表读出。隔膜式压力表及结构如图8-21所示。
图8-21 隔膜式压力表
（4）改变发酵液的理化性质在发酵过程中，由于微生物的生命活动，分解并利用培养液中的基质，大量繁殖菌体，积累代谢产物等都引起发酵液的性质的改变，特别是黏度、表面张力、离子浓度、密度、扩散系数等，从而影响到气泡的大小、气泡的稳定性，进而对KLa带来很大的影响。
2. 需氧的控制
微生物的耗氧量常用呼吸强度和耗氧速率两种方法来表示。影响微生物耗氧的因素有菌体浓度、菌龄、基质种类和浓度及培养条件，其中以菌体（细胞）浓度影响最明显。菌体（细胞）浓度，简称菌浓，是指单位体积培养液中菌体的含量。
一是依靠调节培养基的浓度来控制菌浓。首先确定基础培养基配方中有适当的配比，避免产生过浓（或过稀）的菌体量。然后通过中间补料来控制，如当菌体生长缓慢、菌浓太稀时，则可补加一部分磷酸盐，促进生长，提高菌浓；但补加过多，则会使菌体过分生长，超过临界浓度，对产物合成产生抑制作用。
二是利用菌体代谢产生的二氧化碳量来控制生产过程的补糖量，或利用溶氧的变化自动控制补糖速率，以控制菌体的生长率和浓度，保证产物的比生长速率维持在最大值，又不会使需氧大于供氧。
（五）溶氧控制在发酵过程控制中的应用
溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一。国内外都有将溶氧、pH和补糖综合控制用于青霉素发酵的成功例子。控制的原则是补糖速率正好使生产菌处于所谓“半饥饿状态”，使其仅能维持正常的生长代谢，即把更多的糖用于产物合成，并且其摄氧率不至于超过设备的供氧能力KLa。
溶氧控制可以采用溶氧和补糖控制系统以及溶氧和pH控制系统。溶氧和补糖控制系统中，加糖阀由控制器操纵。当培养液的溶氧高于控制点时，加糖阀开大，糖的利用需要消耗更多的氧，导致溶氧读数下跌；反之，加糖速率便自动减小，摄氧率也会随之降低，引起溶氧读数逐渐上升。
（六）溶氧的测定
目前，发酵过程中溶氧测定大多采用氧传感器来测定，氧传感器又称氧电极，发酵罐中使用的是可蒸汽灭菌的溶氧电极。溶氧电极可分为极谱型和原电池型，如图8-22所示。极谱型需极化电压及放大器，耗氧少，受气流影响小；原电池型简单便宜，适于中小罐，耗氧较大，受气流和气泡影响大。
图8-22 溶氧电极示意图
大多数商品氧电极以Pt为阴极（铂电极），以Ag/AgCl为阳极（银电极），两极的空间充入电解液（KCl或KOH电解液），探头顶端被聚四氟乙烯薄膜（或硅酮膜）覆盖，这种塑料薄膜只允许溶氧透过而不透过水及离子。典型的极谱型的复膜氧电极的构造如图8-23所示。
将探头浸入被测培养液进行溶氧测定时，氧通过膜扩散进入电解液与阴极和阳极构成测量回路。当外加一极化电压（0.6～0.8V）而在两极间产生电位差，在有氧存在的情况下，在电极上将产生选择性的氧化-还原反应，电子转移产生了正比于样品中氧分压的电流，将氧的信号转变成电信号，电极产生的电流强度与被测培养液中的氧分压成正比。被测培养液中溶氧浓度越高，穿过透氧膜和电解液到达阳极的氧分子越多，产生的电流越大，从而建立了传感器产生的电流与培养液中溶氧浓度的关系。测得电流的大小，便可知被测样品中的溶氧浓度。整个反应过程：
阳极：4Ag+4Cl-→ 4AgCl↓+4e
阴极：O2+2H2O+4e→ 4OH-
使用复膜氧电极前，应进行两点标定：
①零点标定将DO电极的前端放在无氧水中（一般采用新配的饱和Na2 SO3溶液放置20min左右后作无氧状态的溶液），将电极放入该溶液中，显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降稳定后，调节零点旋钮显示零值。
图8-23 复膜氧电极
②饱和校正（满刻度）可以采用空气饱和水校准法。用水冲洗电极，插入水中，通气搅拌一段时间，显示仪表上可见溶氧浓度上升，待稳定后，调节满刻度旋钮至100%，即为饱和值。
发酵罐中DO电极的标定方法：在培养基灭菌后，在搅拌、通气和培养温度下将空气饱和度的显示调为100%，待其稳定后便接种，接种后不能再调，直到发酵结束。因此，发酵过程中DO电极显示的读数实际上是标定时溶解氧含量的百分数。使用溶氧电极时，对读数产生影响的有3个物理参数：搅拌、温度和压力。因此，当发酵罐温度、压力、通气搅拌以及发酵液的组成一定时，测得的溶氧的相对含量能反映菌的代谢变化和对产物合成的影响。
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