发酵过程中pH的影响及控制方法

发酵过程中pH的变化，是菌体在一定环境条件下代谢活动的综合性指标，它集中反映了菌体的生长代谢和产物合成的情况。不同菌体在不同发酵过程中的pH变化既取决于菌体的生理代谢，又与环境条件的控制有关。因此，pH能准确反映出环境条件的变化。

（一） pH对菌体生长和产物合成的影响

1. 影响菌体内酶的活性

不同的酶有其最适pH，当菌体中的酶系处于不适合的pH环境时，必然影响到其代谢活动。一般来说，霉菌和酵母菌的最适pH为3～6，大多数细菌和放线菌适于中性或微碱性pH 6.3～7.6。

2. 影响菌体细胞形态及细胞膜的通透性

pH影响菌体细胞形态实际上是pH对细胞生长和代谢途径影响的外部（宏观）表现。例如，在谷氨酸发酵过程中，pH不同，代谢途径不同，菌体形态不同。在青霉素发酵过程中，pH大于6.0时，菌丝体缩短，而pH大于7.0时，膨胀的菌丝体明显的增加。

pH的变化会影响菌体细胞膜的带电状态，从而影响细胞膜的渗透性，必然会影响到营养物质的吸收与代谢产物的分泌。

3. 影响菌体对营养物质的利用

pH影响培养基中的营养成分和中间代谢产物的电离状态，从而影响了微生物对这些物质的正常利用。

4. 影响菌体代谢的方向或产物的质量

pH不同，其菌体代谢途径可能会发生变化，代谢产物也就不同。在谷氨酸发酵过程中，当pH 5.0～5.8时，谷氨酰胺的合成加强，产物主要是谷氨酰胺，pH 7.0～8.0，生成谷氨酸为主；在黑曲霉的柠檬酸发酵过程中，pH 2～3时，菌体合成并分泌柠檬酸，而当pH中性（6～7）时，则合成积累草酸。

青霉素发酵时，在不同pH范围内加糖，青霉素产量和糖耗不一样。具体如表8-7所示。

表8-7 不同pH下加糖对糖耗和青霉素产量的影响

（二）影响发酵液pH变化的因素

发酵过程中pH变化的一般规律：在生长阶段，pH相对于起始pH有上升或下降的趋势；合成阶段，pH趋于稳定，维持在最适于产物合成的范围；自溶阶段，pH又上升。pH变化是微生物在发酵过程中代谢活动的综合反映，其变化的根源取决于培养基的成分和微生物的代谢特性，导致其变化的因素基本相同。

1. 酸性或碱性代谢产物的释放

酸性代谢产物的积累，会导致pH下降。常见的酸性产物有柠檬酸、乳酸、某些酸性氨基酸、二氧化碳（溶解在发酵液中）等。例如，降糖速度过快，供氧不足，有氧氧化途径受阻，会导致乳酸等酸性产物积累。

2. 培养基中生理酸性或碱性物质的利用

常见的生理酸性物质有（NH₄ ）₂ SO₄、（NH₄ ）₂ HPO₄、NH₄ H₂ PO₄、KH₂ PO₄、K₂HPO₄等。当NH₄⁺或PO₄^3-被利用后，可引起发酵液的pH下降。有机氮源和某些无机氮源的代谢起到提高pH的作用，例如，氨基酸的氧化和硝酸钠的还原，玉米浆中的乳酸被氧化等，这类物质被微生物利用后，可使pH上升，这些物质被称为生理碱性物质，如有机氮源、硝酸盐、有机酸等。

3. 碳氮比（C/N）不当

C/N过高，或中间补糖过多，溶氧不足，致使有机酸积累，pH下降；C/N过低（N源过多），氨基氮（NH₄⁺）释放；中间补料中氨水或尿素等碱性物质加入过多。

4. 杂菌污染

污染杂菌，引起pH下降或上升。污染的杂菌有醋酸杆菌、乳酸杆菌、野生酵母等。

5. 菌体自溶

大量的研究表明，发酵液pH的上升，特别是发酵后期，大部分的原因是由于菌体死亡并伴随着菌体自溶造成的。例如，通过研究苏云金芽孢杆菌（Bt）发酵过程中pH、NH₄⁺、氨基酸浓度三者之间的关系时发现，发酵中期，pH上升是由于菌体从以碳素代谢为主的生长期转为以氮素代谢为主产物合成期（伴胞晶体的合成），这个时期，NH₄⁺的浓度变化非常活跃；后期随着代谢的减慢或者停止，NH₄⁺浓度变化仍然很活跃，而且发酵液的pH仍会继续上升。通过镜检发现，发酵后期，发酵液的菌体浓度明显下降，且有大量的菌体碎片存在。

总之，发酵过程中pH变化是由基质代谢、产物形成、杂菌污染和菌体自溶等多方面的原因造成。

（三） pH的监测与控制

对由于菌体代谢所引起的pH变化，需要及时进行监测和控制。

1. pH测量

（1）罐外取样测量 有试纸法（精密级）、酸度计法。罐外取样测量不利于实现自动化管理。

（2）在线监测 目前，现代化的生产企业大部分是采用pH在线（on line ）检测和控制方式，其核心部件是pH检测电极（探头），外加不锈钢护套后安装于罐内，另外有pH显示仪表。工业上在线检测大都使用复合pH电极，如图8-7所示。它结构紧凑，便于安装。这种电极不同于普通的pH检测电极，其基本要求：耐高温，能经受120℃以上、60min的高温处理，需要有压力、温度补偿系统。

图8-7 复合pH电极

把pH指示电极（测量电极）、参比电极（参比电极的液络部是外参比溶液和被测溶液的连接部件，要求渗透量稳定，通常用砂芯的）和被测溶液组合在一起就是复合pH电极。参比电极与指示电极组成一个自发电池，该电池的参比电极的输出电位恒定，指示电极的输出电位随被测体系中氢离子活度而变化。因此整个自发电池的电动势就是被测体系中氢离子活度的函数。(www.xing528.com)

2. pH自动控制系统

pH检测和自动控制系统中，将pH电极发送器与发酵罐的控制仪表连接，通过回路系统控制阀门或泵进行pH调节。pH的直接调节是通过加酸或碱完成，使发酵液的pH控制在设定的数值，具体如图8-8所示。

图8-8 pH自动控制系统

当pH探头测得反应器内的pH高于设定值时，pH放大控制仪向酸泵发出信号滴加酸溶液，否则，向碱泵发出信号滴加碱溶液。pH控制仪通过调节酸碱加入的频度、滴入持续时间来进行控制。实际发酵生产中，一般通过补料控制pH，pH下降时可补加氮源（常用氨水），pH上升可补加糖。

实际操作时，在移种前要通过取样测定发酵培养基的实际pH与记录的在线pH相比较，重新设定pH，其步骤：①取样测定pH，取样试管或烧杯要用发酵液洗涤4次；②根据实际测定的pH与记录的在线pH相比较，重新设定pH；③调节pH到工艺要求，如果有碱罐的，可以将碱管道的进碱阀门打开，然后将P LC控制系统打开到自控；④自接种起，按规定时间取样，根据取样情况，及时调整pH。

（四） pH控制方法

在确定了发酵各个阶段所需要的最适pH之后，为使发酵过程在预定的pH范围内进行，可通过以下方式来控制pH。

1. 配制合适的培养基

配制发酵培养基中常使用一定量的缓冲性物质，以减缓发酵液在发酵过程pH的变化，常用的缓冲性物质有磷酸盐、柠檬酸盐等。磷酸盐、柠檬酸盐均能构成一个缓冲性体系，如，地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶发酵生产中，培养基使用这些成分（柠檬酸盐0.2%、NaH₂ PO₄ 1.4%、Na₂ HPO₄ 0.6%）则可以有效的控制和调节发酵过程中pH的变化。

需要指出的是，磷酸盐等缓冲性物质在灭菌的过程中易与金属离子、大分子物质形成沉淀，在这种情况下，可以单独对这类物质进行灭菌，灭菌完成后，可以无菌操作加到发酵罐中。

2. 直接补加非营养基质的酸碱调节剂

在发酵过程中直接补加酸、碱或部分难溶性中性盐类，如，NaOH、HCl、CaCO₃等，其中CaCO₃在许多发酵过程中都使用，例如，黄源胶、苏云金芽孢杆菌的发酵等。

3. 加入生理酸性或碱性营养基质

常加入的酸性基质有铵盐、油脂、玉米浆（脱NH₄⁺）；碱性基质有硝酸盐、有机酸盐、有机氮、氨水、尿素等。

通氨一般是使用压缩氨气或工业用氨水（浓度20%左右）。在发酵过程中根据pH的变化用加氨水的方法来调节，同时又可把氨水作为氮源供给。由于氨水作用快，对发酵液的pH波动影响大，应采用少量间歇添加或少量自动流加，可避免一次加入过多造成局部偏碱，从而抑制微生物细胞生长。

以尿素作为氮源进行流加调节pH，是目前国内味精厂普遍采用的方法。尿素流加引起的pH变化有一定的规律性，易于控制操作。当流加尿素后，尿素被微生物的脲酶分解放出氨，使pH上升，氨被微生物利用和形成代谢产物，使pH降低，再次反复进行流加就可维持一定的pH。

4. 通过补料来调节

采用补料的方法可以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH和改变培养液的性质（如黏度）等几种目的，效果比较明显。最成功的例子就是青霉素发酵的补料工艺，利用控制葡萄糖的补加速率来控制pH变化（已实现自动化），其青霉素产量比用恒定的加糖速率或加酸、碱来控制pH的产量高25%。其实验结果如图8-9所示。

图8-9 不同调节pH的方法对青霉素G合成的影响

以pH作为补糖的依据，采用控制加糖率来控制pH，把两者紧密结合起来，实现发酵过程的优化，能很好满足菌体合成代谢的要求，使产量提高。具体的流加方法应根据微生物的特性、发酵过程的菌体生长情况、耗糖情况等来决定，一般控制在pH7.0～8.0，最好能够采用自动控制连续流加方法。

（五）发酵控制过程中常见问题及处理

1. 加碱出现问题

在发酵过程中，某个阶段需要加碱调节pH时，出现加碱加不上，可能的原因如表8-8所示。

表8-8 pH加不上的原因分析及解决方案

例如，某公司透明质酸的发酵生产过程中，某一批次的pH在第7h下降，需要加碱时，却加不上。经检查，工作人员排除了其他各种可能原因，发现当时这个批次使用的pH电极为老电极，最后认定是pH电极出现问题。解决方法是按时取样测试pH，并且在下个批次使用新的pH电极。

2. pH一直上升

某产品的一批次发酵控制过程中，工作人员发现pH在12h处突然开始呈现直线上升，并仍然有上升趋势。工程师及时查找原因，最后发现P LC控制终端上的加碱方式是手动加碱，这个直接导致了发酵液的pH迅速上升。解决方法是立刻把加碱方式改为自动控制。

在发酵生产过程中出现pH直线上升可能还有其他原因造成，如表8-9所示。

表8-9 pH直线上升原因分析及解决方案

山东某公司在进行生物肥发酵中，发现接种后pH比正常情况偏高，很快又发现这次pH变化规律一反常态，该升时降，该降时反而升。通过分析查找原因，发现是由于KH₂ PO₄原料有问题，及时采取补救措施后发酵正常进行。正常发酵pH曲线如图8-10所示，异常发酵pH曲线如图8-11所示。

图8-10 正常发酵pH曲线

图8-11 异常发酵pH曲线