（一）种子扩大培养流程
种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶或扁瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。种子扩大培养的目的：①接种量的需要；②菌种的驯化；③缩短发酵时间，减少杂菌污染，保证生产水平。
种子质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。发酵工业生产过程中的种子必须满足的条件：①菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；②菌种细胞的生命力旺盛，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短；③菌种能保持稳定的生产性能，生理性状稳定；④无杂菌和噬菌体的污染；⑤保持稳定的生产能力。因此，菌种扩大培养的任务，不但要获得纯而壮的菌体，还要获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。
在发酵生产过程中，种子制备过程大致可分为两个阶段，即实验室种子制备阶段、生产车间种子制备阶段。实验室种子制备包括孢子制备和摇瓶种子制备，即琼脂斜面、固体培养基扩大培养或摇瓶液体培养；生产车间种子制备是通过种子罐逐级扩大培养，具体流程如图6-1所示。
图6-1 菌种扩大培养流程示意图
1—砂土管 2—冷冻干燥管 3—斜面种子4—摇瓶液体种子 5—茄子瓶斜面种子 6—固体培养基 7， 8—种子罐 9—发酵罐
细菌、酵母菌的种子制备就是一个细胞数量增加的过程。霉菌、放线菌的种子制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。
（二）实验室种子制备
实验室种子制备阶段不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，故称为实验室阶段的种子培养。
实验室种子制备包括孢子制备和摇瓶种子制备，即斜面活化培养、扁瓶固体培养基扩大培养或摇瓶液体培养。实验室种子培养规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。
1. 种子类型
实验室培养阶段得到的种子可以是通过固体培养得到孢子（霉菌和放线菌孢子），也可以是通过液体培养获得的营养细胞（细菌、酵母细胞以及霉菌菌丝体等）。
（1）对于一般不产生孢子的细菌和酵母细胞通过固体试管斜面活化和液体扩大培养得到含有一定数量和质量的菌悬液作为生产阶段种子罐培养的接种物，如谷氨酸的种子培养。
（2）对于产孢子微生物菌种，实验室种子制备一般采用孢子进罐法和摇瓶菌丝进罐法两种方式。
①对于产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用扁瓶固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这种方法称孢子进罐法。采用孢子或孢子悬浮液接种的优点在于：孢子通常是单细胞繁殖体，易纯化分离；操作简便，不易污染杂菌；工艺简单，一次可以制备大量孢子，便于控制孢子质量；分生孢子处于半休眠状态，较营养细胞对环境抗性强，易于保存；孢子进种子罐后，每个个体都能从同一水平起步生长繁殖，实现同步生长或接近同步生长，后代菌丝繁殖比较一致，因而可减少批与批之间的差异，稳定生产。
②对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，则需要把孢子接入摇瓶中使孢子发芽，制备的菌丝体作为种子罐的种子，这种方法称摇瓶菌丝进罐法。其优点：对于生长发芽缓慢的菌种，可以缩短种子在种子罐内的培养时间。缺点：现制现用，菌丝不易保存；批与批之间差异，易造成生产波动。
2. 孢子制备
孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。不同菌种的孢子制备工艺有其不同的特点。
（1）霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮等天然农产品为培养基。营养成分适合霉菌孢子繁殖，这些物质表面积大，易于获得大量孢子。培养温度一般为25～28℃，培养时间一般为4～14d。
米孢子是将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米粒上，恒温培养一段时间后产生分生孢子。以一定量的斜面制备的孢子悬液接入大（小）米或其他固体培养基上，培养成熟后称为“亲米”，由“亲米”再转至大（小）米培养基上进一步放大，培养成熟后称为“生产米”，用“生产米”接入种子罐。米孢子制备工艺流程如图6-2所示。
大米孢子的制备是将大米用水浸泡4h左右，大米∶水=1∶（0.5～0.6），水中加入一定量的玉米浆，晾至半干（能散开，表面无水即可），装入垫有纱布的搪瓷盘内，并在上面用4层牛皮纸盖好，放入蒸锅内在100℃下蒸20min左右蒸熟。降温至温热时摇散，晾至半干，分装于罗氏瓶中（厚度1～2cm），在121℃下灭菌20min，降温至温热时摇散，放置不超过1d。将保藏菌种接种于罗氏瓶中，摇匀，放置于培养装置内培养，定期进行摇动，培养后，加玻璃珠打碎，洗下孢子，用火焰接种至种子罐。小米孢子制备与大米孢子制备相近。
（2）放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。其中的碳源和氮源不要太丰富，因为碳源丰富易造成生长环境呈生理酸性，不利于孢子形成；而氮源丰富则有利于菌丝繁殖，不利于孢子形成。一般情况下，干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。放线菌种子培养工艺如图6-3所示。
图6-2 米孢子的制备流程
母瓶培养用于活化、纯化，使保藏菌种发芽生长，并去除变异株，所以接种时要稀一点，便于纯化生长到单菌落。而子瓶主要用于大量繁殖，得到大量孢子。从母斜面上接种，要选取生长好的单菌落，接种时密一点，可得到大量的孢子。
图6-3 放线菌种子培养工艺
放线菌斜面的培养温度大多数为28℃，少数为37℃或30℃，培养时间一般4～7d，也有长至14d的。孢子成熟后，可放在2～4℃保存备用，一般存放时间7d，少数可以存放1～3个月。或真空抽干至水分含量在10%以下保存备用，一般可连续使用达半年，对稳定生产很有帮助。生产中采取哪一级斜面孢子要根据菌种特性而定。采用母斜面（一级斜面）孢子入罐有利于防止菌种变异和染菌，采用子斜面（二级斜面）孢子接入液体培养基可节约菌种用量。
3. 摇瓶培养及摇瓶液体种子制备
摇瓶培养即振荡培养，是一种能保证好氧菌获得充足溶氧的液体培养方法。摇瓶培养技术问世于20世纪30年代，由于其简便、实用，很快便被发展成为微生物培养中极为重要的技术，并广泛用于工业微生物菌种筛选、实验室大规模发酵试验（生产工艺的改良和工艺参数的优化）及种子培养等。
摇瓶培养设备主要有旋转式摇床和往复式摇床两种类型，其中以旋转式最为常用。用旋转式摇床进行微生物振荡培养时，固定在摇床上的摇瓶随摇床以一定的转速运动，由此带动培养物围绕着三角烧瓶的内壁平稳运动。振荡培养中所使用的发酵容器通常为三角瓶，也有使用特殊类型的烧瓶或试管。振荡培养中，三角烧瓶用6～8层医用纱布或硅胶塞封口，试管塞一般用普通棉塞或胶塞。
（1）摇瓶培养方法 摇瓶振荡培养的目的在于改善活细胞的氧气和营养物的供给。摇瓶供氧实际上就是将摇瓶或试管置于摇床中，通过摇床的振荡来使氧气通过纱布层或硅胶层扩散至瓶内，进而扩散并溶解在液体中供菌体生长和产物形成的需要。摇床转速越快，偏心距越大，通气越好。
摇瓶供氧主要是两种类型：一是供氧相对较大，以产生大量的细胞，常见于丝状微生物（如食用菌、放线菌）中；二是需供氧但所需供氧量较小，常见于细菌。要获得高氧供应，可在较大的烧瓶（250～500mL三角瓶）中盛装相对较小容积的培养基，由此可获得更高的氧传递速率，便于细胞的迅速生长；要获得较低的氧供给，则采用较慢的振荡速率和相对大的培养体积。(www.xing528.com)
就一特定微生物而言，振荡培养时存在一最佳培养基配方和最佳培养基容量。一般来说，振荡培养丝状微生物时培养基最佳容量为一般为50～100mL/500mL三角瓶，或25～50mL/250mL三角瓶，即为所使用的发酵容器容积的10%～20%。在这一范围内，所使用培养基量越小，所得试验结果越好。
在培养过程中应特别注意两个问题：一是温度。通常摇床的工作温度为25～37℃。一般台式摇床都有一通过空气循环或水浴来保持恒温的装置，可使所有的摇瓶内培养基温度处于同一水平。由于电机和机械传动部分的产热、振荡产热和微生物生长代谢释放的热能，使摇瓶中培养基的实际温度要比实际室温高2℃左右，且在强烈振荡时，此温差更为明显。因此，在实验过程中设计高温点时必须注意到这一问题。此外，还要注意摇床中心与边缘、上层与下层的温差，如表6-1所示，列出的实测数据表明，一般摇床上层的温度高于下层，中间的温度高于边缘。如图6-4所示为酿酒酵母摇瓶在摇床上的不同位置示意图。为避免不同位置上摇瓶种子质量的波动，培养时，最好在具有相同温度带的摇床固定位置上进行。
表6-1 酿酒酵母摇瓶在摇床中不同位置上的温度偏差
图6-4 酿酒酵母摇瓶在摇床上的不同位置示意图
注：①O1～O6为摇瓶号位置，上下层各有72瓶；②摇床参数：转速250r/min，偏心距50mm。
另一个十分重要的问题就是维持连续振荡。好氧菌的培养是个需氧过程，因此要不停的振荡，特别是灭菌培养基内几乎没有溶氧，接种之后应充分振荡。振荡不连续进行，哪怕只是数分钟的停顿，对结果的影响都是极显著的，而且由于数分钟的停顿对微生物细胞生长的影响不明显，使影响从表面上不易被发现。有报道，在用黑曲霉生产柠檬酸的发酵试验中，中断通气时柠檬酸的产量直线下降，甚至不可逆转。在繁殖期中断通气20min不会使菌株的活力下降，但菌株积累柠檬酸的能力受到不可逆的破坏或减慢。
（2）摇瓶种子制备 将斜面种子或米孢子接入含液体培养基的锥形摇瓶中，于摇床上恒温振荡培养，获得液体种子，叫摇瓶种子。摇瓶培养为一级种子培养。摇瓶种子可在摇瓶中传代，第一代为母瓶，第二代称为子瓶。摇瓶种子培养工艺过程如图6-5所示。
图6-5 摇瓶种子的制备流程
有些发酵产品（如谷氨酸），一级种子培养不用摇瓶，而是用大型斜面（茄瓶），优点是可一次制备一批大型斜面，置于冰箱中，比液体培养物易于保存，不必每天制备液体一级种子。
①培养基配制：摇瓶培养的目的是获得具有较强生命力的营养菌体，因而摇瓶培养基应全面、均衡和丰富，以便充分满足菌体的生长和对各种营养物质的要求。摇瓶种子在培养过程中一般不便于调节pH，配制时要考虑营养成分中生理酸、碱性物质的平衡搭配或加入磷酸盐、碳酸钙等缓冲剂来控制培养过程中的pH变化。
②分装和灭菌：分装培养基的三角摇瓶用棉塞或胶塞，置高压灭菌器中灭菌。灭菌时要注意不要让蒸汽冷凝水打湿或粘污棉塞或纱布上。
③接种：一般采用斜面种子挖块法或米孢子计数法。这种方法难于掌握接种量，从而影响摇瓶种子的质量。为此可以采用用无菌蒸馏水将斜面种子或孢子制成细胞或孢子悬液，然后按一定体积或一定细胞（孢子）数接种至摇瓶培养基中。
接种时，菌体浓度不能太高，否则影响摇瓶中的菌体对营养成分的竞争及气体交换，降低菌体生长质量。
④恒温振荡培养：将摇瓶种子放置于摇床上一定位置，设置一定的温度和摇床转速，开启摇床进行恒温培养。为了尽可能减少摇瓶在培养过程中水分蒸发量，应将摇床置于一定湿度的环境下。摇瓶一定要固定好，以免培养时出现晃动，或造成摇瓶倾斜及瓶塞脱落。还要注意摇瓶之间不要过紧，否则易造成摇瓶间的碰撞。在培养过程中要定期观察摇瓶种子的培养情况，注意防止由于人为或机械故障导致的摇床不能正常工作或温度过高等情况的发生。
培养时间一般应将摇瓶种子的生长阶段控制在对数生长的后期，可通过观察外观黏稠度、静置沉降量或测定离心湿菌体体积以及镜检进行判断。
⑤保存：经恒温振荡培养获得的摇瓶种子应立即使用，如果暂时不用，可置4℃冰箱中保存，保存期最好不要超过3d。经过保存的摇瓶种子一般不用于生产种子，可用于摇瓶发酵实验或小型发酵罐实验。
（三）生产车间种子的制备
种子培养在种子罐里进行，工厂一般归为发酵车间管理，故称这些培养过程为生产车间阶段。实验室制备的孢子或液体种子还需要移种至小型发酵罐中继续扩大培养，由于其目的是培养种子，为有别于生产产物为目的的大发酵罐，一般把用来培养种子的小型发酵罐称为种子罐。
1. 种子罐的作用
种子罐的作用主要是使实验室培养阶段获得的有限数量的孢子（菌体）发芽、生长并繁殖成大量菌丝体（菌体），满足发酵罐的需要（菌体生长和产物形成）。接入发酵罐后能迅速生长，达到一定的菌体量。比如谷氨酸产生菌种子罐培养的二级种子接入发酵罐经过12h的适应期后，菌体生长停止，谷氨酸开始合成。对于产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖快的菌种，在生产车间阶段，培养物最终一般都是获得一定数量的菌丝体。相比于孢子，菌丝体进入发酵罐的优点在于：缩短了生产罐的发酵时间，提高了设备利用率；减少了杂菌污染的机会；总能耗低。国内大多数柠檬酸工厂均采用使黑曲霉孢子发芽，并发育成酸型菌丝球作为接种物，一般可以缩短发酵时间30h左右。
2. 种子罐大小和级数确定
种子制备过程中，因菌种不同，可采用不同种子罐级数。种子罐级数是指制备种子需要在种子罐中逐级扩大培养的次数。一般根据种子罐从小到大的顺序，将最小的称为一级种子罐，次小的称为二级种子罐，依次类推，种子制备过程如图6-6所示。
种子罐级数主要取决于两方面：①菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；②所采用发酵罐的容积。
通常谷氨酸发酵的接种量为1%，因采用的菌种为细菌，其生长繁殖速度快，工业生产上一般采用两级扩大培养，即：茄子瓶→1000mL摇瓶→种子罐→发酵罐。对于生长较慢的青霉菌，其丝状菌二级种子罐培养，即：大米孢子→一级种子罐（27℃，40h孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27℃，10～24h，菌体迅速繁殖，获得粗壮菌丝体）→发酵罐。
图6-6 种子制备过程
确定种子罐级数需要注意的问题：①种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会；②种子级数太少，则接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会。
酒母车间扩大培养所用的培养基，主要以大生产的原料为主，适当添加一些营养物质。其流程：卡氏罐→小酒母罐→大酒母罐→成熟酒母送发酵车间。
酒母罐的结构，如图6-7所示，均为铁制圆筒形，其直径与高度之比近1∶1，底部为锥形或碟形，底部中央有排出管，罐体密封。罐上装有搅拌器，也有用无菌空气代替机械搅拌，不仅简化设备，还可消除车间噪音。酒母罐内设有兼作冷却或加热用的蛇管。大酒母罐体积是小酒母罐体积的10倍，酒母罐的数目，可根据发酵产量来计算。
图6-7 酒母培养罐
1—人孔 2—CO2排出管3—进醪管 4—视镜 5—温度计 6—冷却水管 7—排醪管
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