（一）影响培养基灭菌的其他因素
1. 培养基成分
培养基中的油脂、糖类和蛋白质等有机物是传热的不良介质，会增加微生物的耐热性，这就要提高灭菌温度或延长灭菌时间。例如，大肠杆菌在水中加热60～65℃、10min便死亡；在10%糖液中，需70℃、4～6min；在30%糖液中，需70℃、30min。如果培养基中存在高浓度的盐类、色素等物质时，则会削弱微生物的耐热性，较易灭菌。
2. 培养基的物理状态
一般固体培养基的灭菌要比液体培养基的灭菌时间要长。液体培养基100℃时灭菌为1h，而固体培养基则需要2～3h，才能达到同样的效果。此外，培养基成分的颗粒越大，灭菌时蒸汽穿透所需的时间越长，灭菌较难；颗粒越小，灭菌越容易。一般对小于1mm颗粒的培养基，可不必考虑颗粒对灭菌的影响，但对于含有少量大颗粒及粗纤维培养基的灭菌，特别是存在凝结成团的胶体时会影响灭菌效果，则应适当提高灭菌温度或过滤除去。
3. pH
pH对微生物的耐热性影响很大。pH在6.0～8.0时，微生物最不易死亡，pH值低于6.0时，氢离子易渗入微生物细胞内改变其生理反应而容易死亡，所以培养基pH越低，所需的时间也越短。培养基pH与灭菌时间的关系如表4-13所示。
表4-13 培养基的pH对灭菌时间的影响
4. 微生物性质与数量
各种微生物对热的抵抗力相差较大。细菌的营养体、酵母、霉菌的菌丝体对热较为敏感，而放线菌及霉菌的孢子对热的抵抗力较强。处于不同生长阶段的微生物，所需灭菌的温度与时间也不相同。繁殖期的微生物对高温的抵抗力要比衰老时期抵抗力小很多，这与衰老时期微生物细胞中蛋白质的含水量低有关。在同一温度下，微生物数量越多，所需的灭菌时间越长，因为微生物数量比较多时，耐热个体出现的机会也越多。此外，还要注意的是天然原料尤其是麸皮等植物性原料配成的培养基，一般含菌量较高，而用纯化学试剂配制成的组合培养基，含菌量低。
5. 蒸汽性质
蒸汽有饱和蒸汽、湿饱和蒸汽和过热蒸汽。对于饱和蒸汽，当压力一定时，其温度也是个定值。高压蒸汽灭菌应采用饱和蒸汽，只有蒸汽的压力和温度相匹配才是保证灭菌效果的重要条件。饱和蒸汽如果继续加热，使蒸汽温度升高并超过沸点温度，此时得到的蒸汽称为过热蒸汽。灭菌器内的过热蒸汽遇到待灭菌物品时不能充分凝结成水，不能释放出足够的热能，不利于灭菌。
另外，灭菌效果还跟蒸汽的饱和度有关，如果灭菌器内的空气未排除或未完全排除，则蒸汽达不到饱和，压力和温度的协调性破坏，可导致灭菌失败。另外，若空气未完全排除，蒸汽不能穿透到待灭菌包裹的中心部位，会发生包内温度低、包外温度高的情况，致使包内达不到灭菌要求。此外，水质、水温和蒸汽的干燥程度都会影响灭菌的效果，灭菌器应使用干燥程度不小于0.9的饱和蒸汽，即蒸汽含水量不超过10%。
概念解析 饱和蒸汽和湿饱和蒸汽
饱和蒸汽的温度与水的沸点相当，当压力达到平衡时，此时蒸汽中不含有微细的水滴。它的特点是热含量较高，穿透力强，还存在潜热（蒸汽变为水的同时所放出的热量），因此灭菌效果好。当遇到比蒸汽温度低的灭菌物体时，这种潜热能迅速提高物体的温度，达到杀灭杂菌的目的。
在蒸汽输送过程中，由于一部分热量损失形成无数细微的水滴混悬在蒸汽之中，称为湿饱和蒸汽，它的特点是蒸汽中带有水分，热含量较低、穿透力差、灭菌效力较低。有些工厂自己烧锅炉产生蒸汽，蒸汽压力波动很大，同时蒸汽中含水量大，温度达不到要求，基本属于此类型的蒸汽。
因此，灭菌蒸汽要求一定要采用饱和蒸汽，冷凝水越少越好。在冷凝水较多或蒸汽管道较长的情况下，蒸汽进车间后的总管上要装设汽水分离装置将冷凝水分离后再使用。灭菌时蒸汽压力要求平稳，在压力变动较大时，操作人员需灵活掌握加以控制。
（二）培养基和设备灭菌中出现的染菌及防止
消后培养基带菌的原因很多，统计表明（表4-14），设备损坏、密封不严以及空气过滤系统带菌等是造成染菌的主要原因。
表4-14 染菌原因及出现的概率
1. 空气系统
空气过滤系统带菌是发酵全过程中引起染菌的重要因素。在灭菌过程中，主要是防止过滤器中过滤介质因蒸汽压力过大被冲翻而造成短路。若空气过滤器前后两个压力表的压力差大于0.03MPa，说明过滤器的滤芯损坏或被浸湿，应停止灭菌，拆开检查，将滤芯更换或吹干，再重新灭菌。
2. 设备及管道的渗漏及 “死角”
（1）发酵罐及其管道渗漏 发酵罐及其管道渗漏涉及很多方面，包括罐体焊接、法兰焊缝等不严密，罐内和罐外各管路腐蚀、穿孔等现象，阀门的掉头、掉垫及泄漏等。发酵罐或种子罐在进料灭菌前一定要经过载荷气压试漏的检查。特别是要定期对罐内的蛇形管、夹套等冷却设备的试压、试漏的检查，应确保发酵罐及附属设备无渗漏。凡与物料、空气、下水道连接的管件阀门保证严密不漏，及时更换泄漏的阀门。(www.xing528.com)
走进企业 焊接泄漏造成的染菌
有一台发酵罐，取样阀门和发酵罐连接处的管路腐蚀穿孔，如图4-14所示。于是更换了一段不锈钢管并与碳钢壁焊接在一起。由于两种钢的材质不同，灭菌遇热冷却后即产生焊缝裂纹渗漏的现象。但是操作者发现该漏点却不以为然，也未采取相应措施，造成该罐多批染菌。当把焊缝重新进行焊接，并做罐体严密度检查合格后，就不再发生染菌现象了。
图4-14 罐壁与接管处泄漏示意图
这个事例说明，不重视严密度检查，哪怕是一个微小的漏点，也会造成染菌的机会。所以，在培养基进罐灭菌前，发酵罐及其附属设备管道一定要认真检查，做到防微杜渐。
灭菌过程中，高温蒸汽所达不到或不能彻底灭菌的部位称为“死角”。主要指设备结构死角和人为操作构成的死角两大类。实际过程中，“死角”还包括发酵设备或连接管道的某一部位和培养基或其他物料的某一部分等。
（2）发酵罐“死角”主要原因是罐焊接处等的周围容易积结污垢，发酵罐制作不良，发酵罐封头上存在各个接口以及发酵罐的修补焊接位置不当等。
取样管经常在蒸汽保护之下，取样后残存菌丝体，被高温烘烤成焦物积累堵塞取样阀芯，造成灭菌“死角”，如图4-15所示。采用环形空气分布管时，远离进口处的管道常被来自空气过滤器中的活性炭或培养基中的某些物质堵塞，最易产生“死角”而染菌。因此，工艺上要做好发酵罐放罐后的检查和清洗工作，清理罐内残渣，去除罐壁上的污垢，清除空气分布管、温度计套管等处堆积的污垢及罐内“死角”，及时更换阀门或空气分布管。
图4-15 取样阀门堵塞示意图
罐内的部件如挡板、扶梯、搅拌轴、联轴器、冷却管等及其支撑件、温度计套管焊接处等的周围容易积累污垢，形成“死角”而染菌。采取罐内壁涂刷防腐涂料、加强清洗并定期铲除污垢等是有效消除染菌的措施。
发酵罐的制作不良也可能造成“死角”，有些发酵工厂为防止铁离子对发酵的影响以及生产的柠檬酸对碳钢壁的影响，罐内壁多用不锈钢衬里。由于焊接质量不好，导致不锈钢与碳钢之间不能紧贴而有空气存在，高温灭菌、低温冷却及压力变化等都可能使不锈钢鼓起或破裂，从而造成“死角”染菌，如图4-16所示。因此，在发酵罐的设计上，绝不采用衬里的方式制造，而应全部采用不锈钢或复合钢制作发酵罐可有效克服此弊端。
此外，发酵罐底常有培养基中的固形物堆积，形成硬块，这些硬块有一定的绝热性，使藏在里面的脏物、杂菌不能在灭菌时被杀死而染菌。通过加强罐体清洗、适当降低搅拌桨位置都可减少罐底积垢，减少染菌。另外，罐底的加强板长期受压缩空气吹打或焊接不当造成灭菌不彻底，如图4-17所示。应煅成与罐底相同弧度，使之吻合紧密，并注意焊接质量。
图4-16 衬里鼓起或破裂造成的 “死角”
图4-17 罐底的加强板形成 “死角”
（3）法兰及移种管道安装“死角”发酵设备中管道之间的安装都是以法兰连接，其内部的垫片与法兰如出现偏差（如垫圈大小不配套、法兰不平整、安装未对中等）会造成“死角”如图4-18所示。因此，法兰加工、焊接和安装要符合灭菌的要求，务必使各衔接处管道畅通、光滑、密封性好，垫片的内径与法兰内径恰好相等，安装时对准中心，以避免和减少管道出现“死角”而染菌。移种管道安装不当也会造成死角，如图4-19（1），消除方法如图4-19（2）所示。
图4-18 法兰安装不当造成的 “死角”
3. 培养基成分
实罐灭菌过程中，最忌讳的是培养基原材料当中的颗粒和杂物，这是造成染菌的主要原因。淀粉质原料，在升温过快或混合不均匀时容易结块，使团块中心部位出现 “夹生”，蒸汽不易进入将杂菌杀死。培养基中诸如麸皮、黄豆饼一类的固形物含量较多，在投料时溅到罐壁或罐内的各种支架上，容易形成堆积物，一些杂菌也不易被杀灭。
图4-19 蒸汽不易达到的“死角”及消除方法
通常对于淀粉质培养基的灭菌采用实罐灭菌较好，升温前先通过搅拌混合均匀，并加入一定量的淀粉酶进行液化。有大颗粒存在时应过筛除去，再行灭菌。对于麸皮、黄豆饼一类固形物含量较多的培养基，可采用罐外预先配料，再转至发酵罐内进行灭菌较为有效。对黏稠培养基的连续灭菌，必须降低料液的输送速度，防止冷却时堵塞冷却管。
4. 灭菌操作不当
主要原因：实消时，由于操作不合理，未将罐内的空气完全排除，造成压力表显示 “假压”；连续灭菌过程中，培养基灭菌的温度及其停留时间没有符合灭菌的要求，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度。
另外，培养基灭菌过程中产生泡沫也对灭菌很不利。因为泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去，不易达到微生物的致死温度，导致灭菌不彻底。泡沫的形成主要是由于进汽排汽不均衡，如果在灭菌过程突然减少进汽或加大排汽，则会出现大量泡沫。一旦灭菌操作完毕并进行冷却时，这些泡沫就会破裂，杂菌就会释放到培养基中，造成染菌。
主要措施：操作者应严格按标准操作规程进行灭菌操作，灭菌过程中蒸汽压力不可大幅度地波动，升压过程不可急剧进汽，对易起泡沫的培养基需加消泡剂，以防止或消除泡沫。
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