工业培养基灭菌操作的方法

工业化生产中培养基的灭菌主要采用高压蒸汽灭菌法，基本工艺过程：培养基→加热升温→维持保温→冷却降温→发酵。具体可采用实罐灭菌和连续灭菌两种操作方法进行灭菌。

（一）实罐灭菌

实罐灭菌（实消）是将配制好的培养基全部输入到发酵罐内或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起加热至灭菌温度后维持一定时间，再冷却到接种温度的灭菌过程，如图4-6所示。这一工艺过程又称为间歇灭菌或分批灭菌。

实罐灭菌操作实际上包括升温、保温、冷却三个过程，如图4-7所示为培养基实罐灭菌过程中温度变化情况。实罐灭菌操作步骤如下。

1. 罐体清洗检查

清洗时应注意罐盖顶部的电器接口不能进水，否则可能会引起电器元件的损坏或数据测量错误。检查设备、管道有无渗漏，主要是冷却管道。检查发酵罐夹套内的冷凝水是否排掉，保证夹套内无冷却水。罐体内部结构合理（主要是无死角），焊缝及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象。

2. 灭菌前准备

把发酵罐的分空气过滤器灭菌，并用无菌空气吹干。关闭空气管路进气阀，打开罐体排气阀卸压。将清洗完并校正好的电极插入罐内，连接好电极线。将配好的物料加入罐内，按照工艺要求加入所需的水定容，加入消泡剂，并检查有没有遗漏的物料。完毕，开搅拌以防料液沉淀。

图4-6 实罐灭菌示意图

3. 加热升温

（1）间接加热 打开罐体各排气阀，同时，关掉夹套冷却水，打开夹套或蛇管蒸汽阀，将蒸汽引入夹套或蛇管对料液进行间接加热，微开夹套进水管排污阀，排出罐体及夹套内的冷凝水。待罐温升至80～90℃，将排气阀逐渐关小。

图4-7 实罐灭菌过程温度的变化情况

夹套进汽预热的作用：①减少冷凝水的生成，保证消后培养基体积的准确性。开始罐内直接进汽，罐体中冷的物料直接冲入蒸汽，极易产生大量冷凝水而使培养基消后体积过大。有的工厂省略此步，需通过试验掌握冷凝水的生成量，确保培养基的浓度。②减轻噪音。物料与蒸汽之间温差过大，直接进蒸汽时会引起设备震动。③有利于淀粉质原料的糊化和液化。夹套升温相对缓慢一些，对淀粉质的物料，有利于培养基中可能存在的尚未完全溶解的物料充分溶解，避免升温太快使物料表面糊化结块，影响灭菌效果。

（2）直接加热 用夹套预热至80～90℃后，关闭夹套进汽阀，打开罐体进汽阀，蒸汽直接通入罐中，使罐温上升到118～120℃，并打开各种排汽阀，并停止搅拌。

4. 保温保压

当物料温度接近工艺规定温度时，逐渐收小蒸汽阀门并调节各阀门的平衡，使压力和温度平稳达到工艺要求的压力和温度（一般比培养温度略高0.5～2℃）。此时要求与反应器相连的所有管道处于两个状态：进汽或出汽，目的是对管道进行灭菌。在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道都应通入蒸汽；在液面上的其余管道则应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底，不留死角。通用发酵罐一般有三个开口（进空气管、出料管、取样管）进蒸汽，这就是所谓的“三路进汽”。“四路出汽”即蒸汽直接从排气、接种、进料和消沫剂管排汽。

5. 冷却降温

灭菌结束后，首先关闭所有的进汽阀，将排汽阀稍微收小一些。接着，当罐内压力低于空气分过滤器压力时，打开进空气阀通入无菌空气，以维持罐压。最后，打开冷却水阀在夹套或蛇管中通冷水进行快速冷却，开搅拌，使培养基的温度冷却至发酵工艺要求的温度。

值得注意的是，空气分过滤器压力要高于罐内压力（一般降至为0.5MPa左右）时才能打开进空气阀，防止培养基倒流入过滤器。灭菌结束后，需要及时引入无菌空气，保证罐内压力（一般调节罐压在0.1MPa）后，方进冷却水冷却。通入无菌空气的作用是加速降温并保持罐内正压，防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌或引起发酵罐破坏（发酵罐的罐压跌零，罐体被吸瘪），这是不锈钢夹套发酵罐在实罐灭菌操作中常发生的事故。

培养基实罐灭菌质量优劣的判断标准有以下四点：①灭菌后达到无菌要求；②营养成分破坏少； ③灭菌后培养基体积与加料体积相符； ④泡沫较少。

灭菌过程中还要注意的几个问题：

（1）灭菌搅拌的作用 在实罐灭菌中，搅拌的作用是十分重要的。开启搅拌的目的：①使灭菌的物料均匀受热、传热，避免实罐灭菌过程中假压力的形成；②避免物料沉积，一旦出现沉淀和分层，也会造成受热温度不一致，易产生假压力。

（2）灭菌后料液体积的变化 配制培养基时，应充分考虑培养基在灭菌后体积的增加。灭菌时间越长，体积增加得越多。夹套没有预热或者预热不够，蒸汽管道内的冷凝水没有排尽，锅炉房送出的蒸汽含水量过大等原因，会形成很多冷凝水使体积增加。

（3）实罐灭菌时间的考虑 在工业化发酵生产中，通常只是把保温维持阶段看作是灭菌的时间。不同规模的发酵罐要到达同样的灭菌效果所需的灭菌维持时间如表4-12所示。

表4-12 不同规模发酵罐的灭菌时间

算一算

有一发酵罐，内装培养基40m³ ，在121℃温度下进行实罐灭菌。设培养基中含有耐热菌的芽孢2×10⁷个/mL，在121℃时的灭菌速率常数为0.0287s^-1。试求灭菌失败的概率为0.001所需的时间。(www.xing528.com)

解：

这里值得注意的是，对40m³的发酵罐进行实罐灭菌，灭菌时间是23.9min，这里没有考虑培养基由室温升至121℃和由121℃降至发酵培养温度这两个阶段的灭菌效应。实际上加热升温对培养基灭菌是有一定贡献的，特别是培养基加热到100℃以上时，这个作用更为明显。

若考虑培养基在加热升温阶段的灭菌效应，假如把培养基从100℃上升至121℃需15min，经计算保温阶段的灭菌时间是21.1min，保温时间缩短了12%。发酵罐体积越大，其实罐灭菌的升温时间越长，升温阶段对灭菌的影响就越大，相应的保温时间就越短。小型罐升温快，升温时间可忽略。当前发酵工业采用发酵罐体积比较大（60～100m³），应考虑到升温阶段的灭菌效应，尽量减少营养成分的破坏。对于发酵罐体积在40m³以下，可不考虑该效应。

另外，降温阶段对灭菌也有一定的贡献，但现在普遍采用迅速降温的措施，时间短，在计算时一般不予以考虑。

（二）连续灭菌

连续灭菌（连续灭菌）是指将培养基在罐外经过专用的消毒设备，连续进行加热、维持和冷却，然后再进入已灭菌发酵罐的灭菌方法。培养基连续灭菌过程中所需时间如图4-8所示。其优点是升温快，营养成分破坏少，生产效率高和自动化程度高。但设备比较复杂，投资较大。

图4-8 培养基连续灭菌的时间

大型发酵罐采用连续灭菌时，空罐需先行灭菌（空消）。但也有在发酵完毕后，将空罐保压不灭菌就进连续灭菌好的培养基，这要根据各厂的生产菌株特性和生产设备等具体情况而定。

连续灭菌对设备的要求：①加热设备：加热均匀，快速升温到灭菌温度（温度一致）；②维持设备：使培养基按顺序流动，维持灭菌温度达到灭菌时间（时间一致）；③冷却设备：传热速率高，尽快冷却到发酵要求温度，密封性好，回收热能。

1. 连消塔加热灭菌流程

连消塔加热灭菌流程如图4-9所示。

图4-9 连消塔加热连续灭菌流程

（1）先在配料罐中将配好的培养基预热到60～75℃。

（2）用连消泵把预热的料液送入加热器（连消塔）底部，用高温饱和蒸汽使料液温度很快升至灭菌温度（一般以126～132℃为宜），停留时间为20～30s。连消塔的主要作用是使高温蒸汽与料液迅速接触混合，并使后者温度很快达到灭菌温度。培养基由塔底进入，在塔内环隙中流动，从塔上部流出。

（3）料液升至灭菌温度后，由连消塔流入维持罐。生产上一般维持时间为5～7min。

（4）灭菌结束后，料液经喷淋冷却器冷却，用冷水在排管外从上向下喷淋，使管内料液逐渐冷却，料液在管内逆向流动。一般料液冷却到40～50℃后，输送到预先灭菌过的罐内。喷淋冷却器结构简单，被广泛使用。

2. 喷射加热器加热灭菌流程

随着发酵工程与技术的进步，目前，实际生产中还可采用喷射加热、管道维持、真空冷却的连续灭菌流程及设备，具体如图4-10所示，流程中采用了喷射加热器如图4-11所示。

图4-10 培养基喷射加热连续灭菌流程

用泵将培养液打入喷射加热器，培养液以较高的速度自喷嘴喷出，借高速流体的抽吸作用与蒸汽混合后，培养液急速升至预定的灭菌温度（140℃），然后在该温度下进入维持管道维持一段时间灭菌。灭菌后的培养基通过一膨胀阀进入真空冷却器，因真空作用使水分急剧蒸发而迅速冷却至70～80℃，再进入发酵罐冷却到接种温度。

图4-11 喷射加热器示意图

1—喷嘴 2—吸入口 3—吸入室4—混合喷嘴 5—混合段 6—扩大管

该流程采用的高温灭菌可以将温度升高到140℃，并且培养基的加热和冷却是瞬时完成的，营养成分破坏最少。同时该流程能保证培养基物料先进先出，避免了过热或灭菌不彻底等现象。

3. 薄板换热器连续灭菌流程

薄板换热器连续灭菌流程如图4-12所示。流程采用了薄板换热器作为培养液的加热和冷却器，蒸汽在薄板换热器的加热段使培养液的温度升高，经维持段保温一定时间后，培养基在薄板换热器的冷却段进行冷却，从而使培养基的预热、加热灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。该流程的加热和冷却时间比喷射加热连续灭菌流程要长些，但由于在培养基预热的同时，灭菌后的培养基也能得到一定的冷却，因而节约了蒸汽和冷却水的用量。板式换热器体积小，换热效率高，但流动阻力较大。

图4-12 薄板换热器连续灭菌流程