培养基湿热灭菌的理论基础探析

（一）微生物的致死温度和致死时间

湿热灭菌的效果，取决于致死温度和致死时间。杀死微生物的极限温度称为致死温度，在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间。在致死温度以上，温度越高，致死时间越短。几类杂菌致死温度和致死时间如表4-8所示。

表4-8 几类杂菌致死温度和致死时间

一般微生物营养细胞在60℃下加热10min即可全部被杀死，而细菌的芽孢要在100℃下保温10min乃至数小时才能被杀死。在实际生产中，由于不能完全了解杂菌的数量和类型，因此，一般评价灭菌彻底与否主要以完全杀死耐热的芽孢杆菌作为依据。

（二）灭菌时间的确定

微生物的湿热灭菌过程，本质上是微生物细胞内蛋白质的变性过程。在一定温度下，微生物的受热死亡符合单分子反应动力学，微生物的热死亡速率与任一瞬间残存的活菌数成正比，即在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随残存的活菌数的减少而递减，这就是对数残留定律，用方程表示：

式中 t——受热时间；

N——灭菌过程中某瞬间的活菌数；

——灭菌过程中某瞬间活菌的减少速率，即死亡速率；

k——灭菌过程中菌体死亡速率常数（s^-1或min^-1 ），是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。

将式（4-1）积分后得对数残留定律的数学表达式：

该公式可变形：

式中 t——表示理论灭菌时间，s；

N₀——开始灭菌（t=0）时原有活菌数，个/mL；

N_t——经时间t后残存活菌个数，个/mL；

k——菌死亡速率常数，s^-1，与微生物的种类和温度有关。

式（4-2）是理论灭菌时间的计算公式。由此式可知，灭菌时间取决于污染程度（N₀）、灭菌程度（N_t）和k值。在实践过程中，因蒸汽压力（不稳定）、蒸汽的流量等有很大差别，甚至培养基中固体颗粒的大小、培养基的黏度等因素，都会影响灭菌效果。(www.xing528.com)

由式（4-3）可知，在灭菌过程中活菌数呈指数减少，如果取N_t=0，那么t=∞，显然与实际不符，也不可能实现。通常生产中对培养基的灭菌要求，即灭菌度为N_t=10^-3个/罐（次），即每处理1000罐（次）中只允许1罐（次）因灭菌不彻底而染菌，或者说因培养基灭菌不彻底而造成染菌的概率是1/1000，这是工业上对培养基达到无菌程度的标准。

微生物死亡速率常数k是微生物耐热性的一种特征，随着微生物种类和灭菌温度而异。相同温度下，不同微生物的k值是不同的（表4-9、表4-10），k值越小，微生物越耐热。如在121℃，细菌芽孢的k值比营养细胞的k值小得多，表明细菌芽孢的耐热性比营养细胞大。因此，k值大小反映了微生物的耐热性。

表4-9 某些细菌的k值（121℃）

表4-10 悬浮于缓冲液中的某些细菌芽孢的k值（121℃）

同一种微生物在不同的温度下，k值也不同。将存活率N_t/N₀的对时间作图，可以得到一条曲线（图4-4）；在半对数坐标上，将存活率N_t/N₀的对数对时间作图，可以得到一条直线（图4-5），其斜率的绝对值即死亡速率常数k值。

图4-4 不同温度下嗜热脂肪芽孢杆菌的残留曲线

图4-5 不同温度下大肠杆菌的残留曲线

因此，对于同一微生物而言，温度升高时，k越大，微生物越容易热死，需灭菌时间越短；反之，温度越低，k越小，微生物越不易热死。

（三）灭菌温度的选择

在实际灭菌过程中，对灭菌的要求：达到无菌程度；尽量减少营养成分损失；降低能量消耗。

湿热灭菌过程中，微生物被杀灭的同时，培养基中的营养成分也受到一定程度的破坏，特别是氨基酸和维生素。培养基组分的破坏主要包括两种情况：①培养基中不同营养成分之间的相互反应。例如，灭菌过程中在热的作用下，通常发生美拉德反应，即棕色化反应，这类反应通常由培养基中的还原糖与氨基酸、肽、蛋白质等发生化学反应，形成5-羟甲基糠醛和类黑精，造成培养基原有营养成分的含量变化，因而影响培养基质量。②热敏感物质的降解，主要是对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解作用。例如，在对嗜热脂肪芽孢杆菌孢子进行杀灭时，达到相同灭菌效果时，不同灭菌温度对维生素B₁损失影响很大（表4-11）。

表4-11 灭菌温度、时间和维生素B₁损失的关系

因此，灭菌过程实质上也是营养成分破坏的过程，灭菌温度和时间的选择应考虑营养成分的破坏，要在保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。

研究证明，随着温度上升，菌体死亡速率增加的倍数要大于培养基成分破坏速率常数增加的倍数。也就是说，温度升高，菌体死亡速率要比营养成分破坏速率快得多。将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死亡速率，缩短灭菌时间，从而减少有效成分的破坏。采用高温短时灭菌既能达到灭菌的效果，又可以减少营养成分的破坏。

尽管高温短时灭菌的优点非常明显，但不能说发酵领域采用高温短时灭菌是唯一的选项，因为高温短时灭菌需要一定的设备条件，通常需要连续灭菌工艺流程。而高温后的快速冷却在大型的生物反应器内也是很难实现的。

在发酵工业中，有时采用分开灭菌的方法来减少营养成分的破坏，即对培养基中糖类等不耐高温的成分与培养基其他成分分开灭菌，冷却后再混合。将培养基成分中的Ca²⁺、Fe³⁺与磷酸盐成分分别灭菌，可避免发生沉淀反应。