微生物是无孔不入、无处不在的，但在自然界却很难找到纯培养状态下生长的微生物。自从发酵工业利用纯培养技术以来，许多发酵过程特别是氨基酸等新型发酵工业都要求纯种培养，如有杂菌，可引起的后果：①生产菌和杂菌同时在培养基中生长，结果丧失了生产能力；②杂菌的生长速度有时比生产菌生长得快，结果使反应器中以杂菌为主；③杂菌会污染最终产品；④杂菌所产生的物质，使提取产物时发生困难；⑤杂菌降解所需要的产物；⑥如污染噬菌体，可使生产菌株发生溶菌现象。
概念解析 消毒和灭菌
消毒通常指的是用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的部分病源微生物，使之不再发生危害。消毒只是杀死微生物的营养体，许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀死，即在消毒后的环境里和物品上还可能有活着的微生物。
灭菌不同于消毒，灭菌指的是用物理或化学方法杀死或除去（物体表面或内部）环境中所有微生物（或生物体），包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。工业中一般笼统地称为杀菌或灭菌。工程上灭菌是指使用物理或化学方法将培养基中的杂菌细胞和孢子杀灭至不影响发酵为限。
灭菌的方法很多，总的可以分为物理灭菌和化学灭菌。物理灭菌包括热力灭菌、辐射灭菌、过滤除菌等，化学灭菌是采用化学试剂进行灭菌。
（一）热力灭菌
每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。当微生物处于最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质体和酶发生不可逆的凝固变性，使微生物在短时间内死亡，热力灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。
热可以灭活一切微生物，包括细菌繁殖体、真菌、病毒和细菌芽孢。因此，热力灭菌在所有可利用的灭菌方法中应用最早、效果最好、使用也最广泛。热力灭菌包括干热灭菌和湿热灭菌。
1. 干热灭菌
（1）火焰灼烧灭菌 火焰灼烧灭菌即利用火焰直接将微生物烧死。这种方法灭菌迅速、可靠、简便，适用于耐火材质（如金属、玻璃、瓷器等）的物品与用具的灭菌，一般不适合药品的灭菌。在实验室的接种操作中，金属接种工具、试管口、锥形瓶口及涂布用玻璃棒等的灭菌，就是采用这种方法；一些耐高温的器械（金属、搪瓷类），在急用或无条件用其他方法消毒时也可采用此法。
（2）干热空气灭菌 利用高温（160～170℃）干热空气（相对湿度20%以下）加热灭菌。干热灭菌由空气导热，在干燥状态下，因热穿透力差，微生物耐热性较强，需长时间受高温作用才能达到灭菌目的。一般繁殖体在80～100℃干热1h可以杀死，芽孢需160～170℃经2h方可杀死。干热灭菌温度和时间关系如表4-1所示。
表4-1 干热灭菌温度和时间的关系
该法适用于耐高温金属、玻璃等物品与用具的灭菌以及不允许湿气穿透的油脂类（如油性软膏基质、注射用油等）和耐高温的粉末化学药品的灭菌，不适于橡胶、塑料及大部分药品的灭菌。
大多数干热灭菌是利用电热或红外线在某设备内加热到一定温度将微生物杀死，例如，实验室常用的干燥箱对玻璃器具等的灭菌，常采用160℃，120min。
2. 湿热灭菌
在实验室或工业生产中，对于培养基、管道、设备的灭菌，通常采用蒸汽加热到一定温度，并保温一段时间的灭菌方法，称之为湿热灭菌。湿热灭菌通常采用饱和水蒸气、沸水进行灭菌。
（1）煮沸灭菌 系指将待灭菌物品置于沸水中加热灭菌的方法。该法灭菌效果较差，煮沸（100℃）5h，能杀死一般细菌的繁殖体，许多芽孢需经煮沸5～6h才死亡。必要时可加入适量抑菌剂，如三氯叔丁醇、甲酚及氯甲酚等，以提高灭菌效果，煮沸时间通常为30～60min。另外，水中加入2%碳酸钠，可提高其沸点到105℃，既可促进芽孢的杀灭，又能防止金属器皿生锈。煮沸法可用于饮水和一般器械（刀剪、注射器等）的消毒。
（2）巴氏消毒 有些物品不能加热到蒸煮温度（100℃左右），可采用较低的温度，如62℃加热30min，以杀死不耐高温的微生物营养细胞（对芽孢无效）。这种方法是法国微生物学家巴斯德首创的，故名 “巴氏消毒法”。
巴氏消毒法利用病原菌不耐热的特点，用适当的温度和保温时间处理，将其全部杀灭，因而是一种以杀死致病菌为主而又保护营养成分不被破坏的消毒方法，常用于消毒牛乳和酒类等。
（3）高压蒸汽灭菌 利用具有适当压力和温度的饱和水蒸气对物料或设备进行灭菌。其灭菌原理：蒸汽冷凝时释放出大量潜热并具有强大穿透力，在高温和有水存在时，微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键（特别是氢键）极易受到破坏，引起不可逆变性，致使微生物在短时间内因代谢障碍而死亡。如乙型肝炎病毒能耐受干热160℃达4min，而在高压蒸汽121℃下作用1min就能破坏其抗原性。多数细菌和真菌的营养细胞在60℃下处理5～10min后即可杀死，酵母菌和真菌的孢子稍耐热，要用80℃以上的高温处理才能杀死，而细菌的芽孢最耐热，一般要在120℃ 下处理15min才能杀死。通常灭菌时，使用的压力为0.107MPa，此时饱和水蒸气对应的温度可达到121℃，该温度下的灭菌时间一般为20～30min，灭菌时间和温度的规律如图4-1所示。
图4-1 灭菌时间和温度规律
高压蒸汽灭菌常用于培养基、发酵设备、附属设备（管道）、实验器材及工作服等的灭菌。高压灭菌器是常采用的灭菌设备，如图4-2所示。目前使用高压蒸汽灭菌器有手提式、卧式、立式，基本原理都是以蒸汽为灭菌介质，用一定压力的饱和蒸汽，直接通入灭菌器内，对待灭菌品进行加热灭菌。锅内饱和蒸汽压力与温度的对应关系如表4-2所示。
图4-2 高压灭菌器
表4-2 某灭菌锅饱和蒸汽压力（表压）与温度的关系
高压蒸汽灭菌的关键是为热的传导提供良好条件，其中最重要的是使冷空气从灭菌器中顺利排除。因为冷空气导热性差，阻碍蒸汽接触欲灭菌物品，并且还可降低蒸汽分压使之不能达到应有的温度。如果灭菌器内冷空气排除不彻底，压力表所显示的压力就不单是罐内蒸汽的压力，还有空气的分压，因此，罐内的实际温度低于压力表所对应的温度，造成灭菌温度不够，如表4-3所示。
表4-3 空气排除程度与罐内温度的关系(www.xing528.com)
注：1atm=1.01325×105Pa。
概念解析 蒸汽压力
蒸汽压力一般指的是蒸汽的表压力，即管路或容器内介质的工作压力，蒸汽的绝对压力指的是表压力与大气压力之和。对于饱和蒸汽，蒸汽压力指的是相应温度下对应的饱和蒸汽压力，是由水的基本性质决定的。在灭菌过程中，经常使用的表压力单位一般用MPa、kPa表示，物理学上常用标准大气压（atm），欧美等国家习惯使用磅/英寸2 （psi，lb/in2 ）作单位。具体换算关系：
1atm=0.1013MPa；
1psi=6.895kPa。
干热灭菌与湿热灭菌虽然都是利用热力作用杀菌，但由于本身的性质与传导介质不同，所以其灭菌的特点亦不一样，如表4-4所示。
表4-4 干热灭菌与湿热灭菌的比较
湿热与干热各有特点，互相很难完全取代，但总的说来，湿热的灭菌效果较干热好，所以使用也普遍。湿热较干热灭菌效果好的原因有三：①蛋白质在含水多时易变性，含水量越多，越易凝固（表4-5）；②湿热穿透力强，传导快（表4-6）。③蒸汽具有潜热，当蒸汽与被灭菌的物品接触时，可凝结成水而放出潜热，使湿度迅速升高，加强灭菌效果。
表4-5 蛋白质含水量和凝固温度的关系
表4-6 干热与湿热穿透力的比较
（二）辐射灭菌
辐射灭菌是利用电磁辐射产生的电磁波杀死物品上微生物的一种有效方法。用于灭菌的电磁波有微波、紫外线（UV）、X射线和γ射线等，在发酵工业中常用紫外线进行灭菌。
紫外线灭菌是一种使用简便的灭菌方法。紫外线使DNA分子中相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体，抑制DNA复制与转录等功能，从而杀死微生物。紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗力较强。波长为253.7nm的紫外线易被细胞中核酸吸收，杀菌作用最强。紫外线可被不同的表面反射，穿透力较弱，普通玻璃、纸张、尘埃、水蒸气等均能阻挡紫外线，因此，对固体物料灭菌不彻底，主要用于表面灭菌，如食品表面、食品包装材料等。液体物料灭菌时，可使液体料，如饮料、牛乳等以薄层状通过紫外线照射区即可灭菌。如果紫外线与空气加热、双氧水和乙醇等灭菌方法结合使用，可大大增强其灭菌能力。紫外线一般用于手术室、病房、实验室的空气消毒。
用于辐射灭菌的装置包括微波炉、紫外光灯、阴极射线管、X射线发生器、放射性核素等。
（三）过滤除菌
过滤除菌是用过滤的方法将液体或空气中的细菌除去，以达到无菌目的。主要用于血清、毒素、抗生素等不耐热生物制品、培养基及空气的除菌。所用的器具是含有微小孔径的过滤器，包括固定孔径过滤器（对应于绝对过滤器）和非固定孔径过滤器（对应于深层过滤器）。由于过滤操作之前或之后要对过滤器进行蒸汽灭菌，所以，过滤介质必须具有在高温下的热稳定性。
针对热敏性的物料或培养基，尤其是动物培养基，因为其含有热不稳定性蛋白质，不能用蒸汽灭菌，而采用固定孔径过滤器进行过滤除菌。工业好氧发酵需要大量的无菌空气，均采用深层介质过滤除菌系统制备。
微生物学实验室最常用的除菌滤器是膜滤器，如图4-3所示。滤膜通常由醋酸纤维或硝酸纤维构成，孔径一般选择为0.45μm，用于对少量的液体的除菌，如滤除血清和酶液中的微生物。
图4-3 膜滤器
（四）化学灭菌
化学灭菌是用化学药剂直接作用于微生物而将其杀死的方法。一般化学药剂无法杀死所有的微生物，而只能杀死其中的病原微生物，所以起消毒剂作用，而不起灭菌剂作用。能迅速杀灭病原微生物的药物，称为消毒剂；能抑制或阻止微生物生长繁殖的药物，称为防腐剂。但是一种化学药物是杀菌还是抑菌，常不易严格区分。
化学药剂灭菌的原理是利用药物与微生物细胞中的某种成分产生化学反应，而破坏细菌代谢机能，如使蛋白质变性、核酸的破坏、酶类失活、细胞膜透性的改变而杀灭微生物。由于化学药剂会与培养基中的蛋白质等营养物质发生反应，加入后还不易去除，所以不适用于培养基的灭菌，主要用于生产车间、无菌室、接种用小器具及双手的消毒等。
常用的化学药剂有乙醇、臭氧、环氧乙烷、甲醛、石炭酸、过氧乙酸、高锰酸钾和新洁尔灭等。化学药剂灭菌的使用方法，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、熏蒸等方法。如表4-7所示列出了常用化学药剂及使用方法。
表4-7 常用化学杀菌剂及应用
续表
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