柠檬酸产生菌的筛选与诱变处理

一、任务目标

（1）掌握从土壤中分离工业用微生物的原理及方法。

（2）掌握利用变色圈法筛选产酸菌的方法。

二、操作原理

目前工业生产柠檬酸中多以黑曲霉为产生菌。黑曲霉耐酸性较强，在pH1.6时仍能良好生长。考虑到柠檬酸生产菌应该具有产酸能力强和耐柠檬酸浓度高的特性，可以采用酸性营养滤纸法分离该菌，简单易行，再加上用变色圈法进行初筛，使产柠檬酸的菌株更易被选出。以产酸能力的强弱作为复筛指标，筛选一株较高产柠檬酸的菌株，复筛时着重以其最本质的因素（产酸率）作为指标。

本任务对一株黑曲霉通过紫外线诱变处理。15W紫外灯在30cm处的紫外线波长多数为260nm左右。当菌体处在这样的波长条件下就会吸收大量能量造成DNA分子发生断裂、分子结构形式发生改变。通过诱变处理，进一步筛选突变菌株，从而使野生型或出发菌株的性状得到改良。

三、材料器具

1. 材料

（1）斜面培养基PDA培养基。

（2）察氏培养基（加0.04%溴甲酚绿）蔗糖30g，NaNO₃ 3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄ 1g，KCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，溴甲酚绿0.4g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

（3）化学试剂：正丁醇，冰乙酸，酚酞指示剂，无菌生理盐水。

2. 主要仪器设备

15W紫外灯，培养皿，滤纸，新华一号滤纸，层析缸，磁力搅拌器。

四、任务实施

（一）柠檬酸产生菌的分离筛选

1. 分离

采用酸性滤纸法。用薯干粉10g、柠檬酸15g和土壤水稀释浸出液100mL混合，倒入少许于培养皿中的数层滤纸上（滤纸要全部湿润），在30℃下培养。待长出黑褐色具有黑曲霉特征的菌落，挑到斜面上。

观察菌落形态特征，挑选出黑曲霉疑似菌株，接种到培养基上培养2d，然后重复进行这一操作，进行多次分离纯化（三次），以确保分离到的是黑曲霉。根据所参照的文献在显微镜下观察黑曲霉的孢子和菌丝特征。

2. 初筛

采用变色圈法。将分离纯化所得黑曲霉（菌落丰厚边缘整齐、生长旺盛的单菌落）连续划线接种到察氏琼脂培养基上，30℃恒温培养3～4d，菌落周围有黄色的变色圈（溴甲酚绿指示剂遇酸会产生颜色反应）。快速测定菌落及周围变色圈直径的大小，选择生长较快、变色圈与菌落直径之比相对较大者作为初筛菌株。

3. 复筛

将初筛得到的黑曲霉（变色圈明显）配制成菌悬液接种到查氏液体培养基中，摇瓶发酵3～5d。

纸层析法测定柠檬酸的纯度：层析纸用新华一号滤纸，显色剂为0.04%的溴甲酚绿溶液，展开剂为正丁醇∶冰乙酸∶水=12∶3∶5，点样10μL，温度24～26℃，上行2～3h。

然后用0.1429mol/L的NaOH溶液滴定10mL的发酵液，记录各自消耗NaOH的体积并计算产酸量和产酸率。

产酸量的测定：取1mL发酵液，加入5mL蒸馏水，以酚酞为指示剂，用经标定的0.1429mol/L NaOH溶液滴定至浅粉红红色时为滴定终点。按如下公式计算产酸量（以柠檬酸计）和产酸率：

产酸量（g/L） =（V-V₀）×c_NaOH ×M/样品毫升数；(www.xing528.com)

式中

V——发酵液样品滴定消耗的NaOH体积， mL；

V₀——以空白培养基为对照滴定消耗的NaOH体积， mL；

c_NaOH——NaOH溶液的浓度， mol/L（0.1429mol/L）；

M——柠檬酸的相对分子质量（243）。

产酸率（g/L）为产酸量/发酵滤液的体积。

（二）黑曲霉菌株的诱变处理

1. 孢子悬液制备

挑取出发菌株固体斜面，用无菌生理盐水洗下孢子，制成孢子悬液，调整孢子液浓度为10⁵～10⁶个孢子/mL。

2. 紫外线处理

照射处理前，先开紫外灯预热20min使灯的功率稳定。然后取2mL孢子液加入无菌培养皿中，置于电磁搅拌器上，放在紫外灯（15W，灯距为30cm）正中下方，将整个培养皿照射1min后，打开皿盖，启动电磁搅拌器并计时，分别照射15，30，45，60min。将处理过的孢子液适当稀释，涂皿分离，选出菌落移至斜面上培养，并进行摇瓶发酵，测定产酸。

3. 产酸量的测定

产酸量的测定同上述测定方法。

五、结果分析

（1）柠檬酸纯度的纸层析法测定情况分析。

（2）初筛得到的黑曲霉菌株产酸量的测定。

（3）比较不同时间紫外诱变处理下的产酸量和产酸率。

六、注意事项

（1）紫外线照射计时从开盖起，加盖止。

（2）紫外线处理时，要戴防护镜，以防紫外线灼伤眼睛。

七、任务考核

（1）纸层析法的正确操作。（40分）

（2）紫外诱变处理操作规范。（20分）

（3）产酸量的正确测定。（40分）

项目拓展（二）