如何从土壤中分离高产淀粉酶菌株？

一、任务目标

（1）掌握平板稀释涂布法、分离筛选产淀粉酶菌株的基本原理。

（2）初步掌握从土壤样品中分离筛选产淀粉酶菌株的基本方法。

二、操作原理

鉴别培养基是用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种变化可将该种微生物与其他微生物区分开来。

一般高产淀粉酶芽孢杆菌的菌落较大，中央有皱褶、圆形、规则、无光泽、灰白色、不透明。显微镜观察菌体特征：杆状，直或接近直，多数运动，有侧生鞭毛，芽孢中生，椭圆形。

三、材料器具

1. 材料

（1）菌源选择含淀粉丰富的土壤为最佳。

（2）平板筛选培养基可溶性淀粉2%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，牛肉膏0.5%，琼脂1.5%～2%，121℃灭菌20min。

（3）分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基加0.2%可溶性淀粉，即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中，pH调至7.2，121℃灭菌15min。

2. 主要仪器设备

锥形瓶，移液管，试管，接种环，涂布棒，培养皿，天平，灭菌锅，培养箱，摇床，离心机等。

四、任务实施

1. 样品稀释

称取土壤样品1g溶于9mL无菌水中，或水样品5mL溶于45mL无菌水中，分别用无菌水梯度稀释至1×10⁷倍。

2. 分离

取1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷稀释液涂布于平板筛选培养基表面，37℃培养72h。等长出菌落后，根据菌落不同挑取菌落进行保存并编号。(www.xing528.com)

3. 初步筛选

将检测试剂（碘液）加入到平板中，涂布均匀，菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株，记其编号，以便进行复筛。

4. 摇瓶复筛

将初筛分离到的产淀粉酶菌株活化后接入装有分离培养基液体培养基的三角瓶中，于30℃摇床进行发酵培养48h，发酵液8000r/min离心5min，取上清液。

在检测培养基上打孔后，将上清液加入孔中，放入恒温箱中静置8h取出，把碘液加入到平板中，涂布均匀，水解圈大的其发酵上清液中淀粉酶的活性就高，取活性最高的菌株作为目的菌株。

五、结果分析

（1）菌落形态观察。

（2）显微镜观察菌体特征。

（3）土壤中有淀粉酶活性细菌的比例。

（4）水解圈大小测量。

六、注意事项

（1）严格无菌操作，防止污染情况的发生。

（2）分离菌株时，稀释度不够导致水解圈黏连。

七、任务考核

（1）样品稀释和划线分离的正确操作。（30分）

（2）平板初筛及水解圈形成明显。（30分）

（3）摇瓶培养及水解圈大小的正确测量。（40分）