诱变育种包括出发菌株的选择、诱变处理和筛选突变株三个部分。
（一）诱变育种的一般步骤
诱变育种的一般步骤如图2-9所示。
图2-9 诱变育种一般步骤
1. 出发菌株的选择
出发菌株是指用于诱变处理的原始菌株。它可以是从自然界分离到的野生型菌株，也可以是正在使用的生产菌株或从其他单位购买的菌株。选择的原则是菌种要对诱变剂有较强的敏感性、变异幅度大、产量高。
2. 同步培养
同步培养，又称为前培养，是指在诱变育种中，处理材料一般采用生理状态一致的单倍体或单核细胞，即菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态。同步培养的目的就是为了获得生理状态一致的培养物，这样才能保证突变率高，重现性也好。细菌一般要求培养至对数生长期；霉菌处理使用分生孢子，应该将分生孢子在液体培养基中短时间培养，使孢子孵化，处于活化状态，并恰好未形成菌丝体。
3. 单细胞（或单孢子）悬液制备
在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的悬液状态。这是因为，一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，还可减少分离现象发生；另一方面又可避免长出不纯菌落。菌龄为对数期细胞、刚成熟的孢子或活化的孢子；菌悬液浓度一般真菌孢子或酵母菌细胞悬浮液的浓度为106个/mL、放线菌或细菌的浓度为108个/mL左右。菌悬液的孢子或细菌数可用平板计数、血球计数器计数和光密度计数。
4. 诱变处理
通过诱变剂对单细胞（或单孢子）悬液进行处理，诱变剂包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂。其中，物理诱变剂包括紫外线、X射线、γ射线、快中子等；化学诱变剂包括烷化剂（如甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝基乙基脲、乙烯亚胺及氮芥等）、天然碱基类似物、脱氨剂（如亚硝酸）、移码诱变剂、羟化剂和金属盐类（如氯化锂及硫酸锰等），各种化学诱变剂常用浓度及处理时间如表2-6所示；生物诱变剂包括噬菌体等。物理诱变剂因其价格经济，操作方便，所以应用最为广泛；化学诱变剂多是致癌剂，对人体及环境均有危害，使用时须谨慎；生物诱变是利用噬菌体、转座子将遗传物质DNA片断载入细胞，使其在复制过程中嵌入新的信息，由此获得高产菌株。
表2-6 几种化学诱变剂常用浓度及处理时间
复合处理是用两种以上的诱变剂先后处理菌株，实践证明复合处理要比单一处理突变率要高3～4倍，金色链霉菌的高产株就是用紫外和乙烯亚胺复合处理后筛选得到的。诱变剂复合处理效果如表2-7所示。
在生产实践上，选用哪种诱变剂、剂量大小、处理时间等，都要视具体情况和条件，并经过预备实验后才能确定。一般以诱变后微生物的致死率在90%～99.9%的剂量为最佳剂量。一般认为，偏低的剂量处理后正突变率较高，而用较高的剂量时则负突变率较高，但高剂量造成损伤大、回复少，如图2-10所示。目前趋向采用低剂量、长时间处理，尽管致死率较高，而诱变效果较好。
表2-7 诱变剂复合处理效果
5. 突变株的筛选
菌种经诱变处理后，—般还要经过初筛和复筛两个阶段。前者以量（选留菌株的数量）为主，后者以质（测定数据的精确度）为主。
图2-10 紫外线照射剂量与龟裂链霉菌土霉素某高产菌株变异的关系
6. 发酵生产性能测定
发酵生产性能测定包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH、提取工艺等。
7. 培养基和培养条件的调整
利用单因子法、正交实验法、均匀设计、响应面法等方法进行培养基和培养条件的优化，以充分发挥高产菌株的高产性能。
（二）营养缺陷型突变菌株的筛选与应用
1. 有关基本定义
（1）营养缺陷型指野生型菌株因某些物理或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物（如氨基酸、核酸碱基、维生素）的能力，只能在补充了相应生长因子的培养基上才能正常生长。从野生型经诱变筛选得到的这类菌株，称为营养缺陷型。这类菌株可以通过降低或消除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物积累。在氨基酸、核苷酸生产中已广泛使用营养缺陷型菌株。
（2）基本培养基仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的培养基。(www.xing528.com)
（3）完全培养基含有满足某微生物的所有营养缺陷型和野生型菌株生长所需营养物质的天然或半合成培养基。完全培养基营养丰富，全面，一般可在基本培养基中加入富含氨基酸，维生素和碱基之类的天然物质配制而成。
（4）补充培养基补充一种或数种生长因子，以满足某微生物特定的营养缺陷型生长的培养基，其中的生长因子多是通过直接添加氨基酸、碱基或维生素而提供。
2. 营养缺陷型菌株的筛选
营养缺陷型菌株筛选包括诱变处理、淘汰野生型（浓缩）、检出营养缺陷型、确定生长谱等步骤。
（1）淘汰野生型菌株方法 限制营养成分使缺陷型细胞生长受抑制，野生型细胞在生长过程中被杀死或生长后被除去。淘汰野生型菌株（浓缩）的方法有抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法等。
抗生素法：某些抗生素能杀死生长繁殖的微生物，而对处于休止状态的微生物无杀伤作用。如青霉素能抑制细菌细胞壁肽聚糖的生物合成。
菌丝过滤法：适用于放线菌、霉菌等丝状微生物。在基本培养基中野生型孢子能萌发长成菌丝体，而营养缺陷型孢子则不生长。将经诱变处理的孢子接种于液态基本培养基中，振荡培养10～12h，使野生型长成菌丝体，然后以滤纸、棉花等介质过滤，菌丝被滤除，未萌发的缺陷型孢子能顺利通过，从而达到富集营养缺陷型的目的。
差别杀菌：利用芽孢或孢子比营养细胞更耐热的特点，先将诱变处理的细菌形成芽孢，把芽孢在基本培养液中培养一段时间，然后加热杀死营养体。由于野生型芽孢能萌发所以被杀死，而营养缺陷型不能萌发而得以存活。
（2）检出缺陷型 浓缩后得到的营养缺陷型菌株比例较大，但不能保证全部为营养缺陷型菌株，还需要进一步分离。
逐个检出法（点种法）如图2-11所示。把经诱变处理并淘汰野生型后的菌液（细胞或孢子）在完全培养基上涂布分离，将培养后长出的每一个菌落逐个、同时分别点种在基本培养基和完全培养基上，凡在基本培养基上不能生长而在完全培养基的相应位置能生长的菌落，为营养缺陷型。
图2-11 营养缺陷型菌株逐个检出法
影印法如图2-12所示。将丝绒布包在直径小于平皿的圆柱台上，固定，作为影印接种工具，灭菌备用。这个类似印章的工具，可以使菌落位置不变地从一个平皿转移至另一个平皿。具体操作方法是将经诱变处理并淘汰野生型的菌液涂布于完全培养基表面上，培养，待长出菌落后，用影印接种工具在此平板上轻按一下（注意不要粘上培养基），然后轻轻地分别印在另一基本培养基和完全培养基上。经培养后，在基本培养基上不长而在完全培养基的相应部位上生长的菌落，为营养缺陷型。
图2-12 营养缺陷型菌株影印检出法
（3）鉴定缺陷型 营养缺陷型选出后需要鉴定。常用生长谱法，即在基本培养基中加入某种物质时，能生长的菌便是该种物质的缺陷型。首先要鉴定哪一类生长因子，然后再鉴定具体因子。
①缺陷型类别的鉴定：将生长在完全培养基斜面上的待测缺陷型菌株细胞或孢子用无菌水洗下（或液体培养后离心收集的菌体细胞），制成106～108个/mL菌悬液。取1mL菌悬液与基本培养基（融化并凉至50℃）混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿背面用记号笔划分三个区域，然后在平板的三个区域分别贴上蘸有三大类营养物质的圆形滤纸片。经培养后，发现某一类营养物质的滤纸片周围出现微生物生长圈，说明该待测菌株在生长时需要补充该类营养物质，该菌株为这类营养物质的营养缺陷型菌株。如果滤纸片蘸有酵母膏水溶液，无论哪类缺陷型菌株，滤纸片周围均会出现微生物生长圈，因为酵母膏水溶液中氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶均有。例如，营养因子为：
a. 酪素水解液（或氨基酸混合液），代表氨基酸类；
b. 水溶性维生素混合液，代表维生素类；
c. 核酸水解液（碱基），代表嘌呤、嘧啶类。
三大类营养物质缺陷鉴定如图2-13所示。
②缺陷营养因子的确定：可以采用滤纸法，将某缺陷型菌悬液分别接种到不同的补充培养基，每一种补充培养基中只添加一种营养成分，如一种氨基酸或一种碱基。如果在添加某种营养成分的补充培养基中能正常生长，那么被鉴定的突变型就是该营养成分缺陷突变型。例如在添加有腺嘌呤的培养基中能正常生长，该突变型就是腺嘌呤营养缺陷突变型。缺陷营养因子的确定也可用营养组分分组法。
图2-13 三大类营养物质缺陷鉴定
3. 营养缺陷型菌株的应用
在科学研究中，营养缺陷型既可作为研究代谢途径和杂交、转化、转导、原生质体融合等遗传规律所必不可少的标记菌种，也可作为氨基酸、维生素或碱基等生物测定的试验菌种。在生产实践中，营养缺陷型可作为菌种杂交、重组育种和构建工程菌时所不可缺少的带有特定基因标记的亲本菌株。它们还常被用作生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株，由于营养缺陷型在代谢途径中某一步骤发生缺陷，致使终产物不能积累，从而遗传性地解除反馈抑制，使中间代谢产物或另一分支途径的末端产物得以积累。
一个典型的例子是谷氨酸棒状杆菌的精氨酸缺陷型突变株进行鸟苷酸发酵，如图2-14所示。由于合成途径中由鸟苷酸生成瓜氨酸的酶（氨基酸甲酰转移酶）缺陷，必须供应精氨酸和瓜氨酸，菌株才能生长，当这种供应维持在亚适量时，菌株达到最高生长水平，又不引起终产物（精氨酸）对酶（N-乙酰谷氨酸激酶）的反馈抑制，从而使鸟氨酸得以大量分泌。
图2-14 利用谷氨酸棒状杆菌的精氨酸缺陷型进行鸟氨酸发酵机制
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