发酵工业中菌种的优化

直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，称作自然选育或自然分离。自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，往往低产，不能满足育种工作的需要，只有经过进一步的人工改良才能真正用于工业生产。诱变育种可以获得高产菌株，但不能达到定向育种的目的。随着现代生物技术的发展，杂交育种、原生质体融合、DNA重组以及代谢工程等均可达到改良菌种的目的。

（一）诱变育种

利用物理、化学或生物制剂等因素，使微生物的遗传物质发生变异导致物种的遗传性状改变，从而获得生产上的优良菌株的方法统称诱变育种。诱变育种与其他育种方法相比，具有操作简便、速度快和收效大的优点，至今仍是一种重要的、广泛应用的微生物育种方法。

（二）杂交育种

生产上，长期使用诱变剂处理，会使菌种的生活能力逐渐下降，利用杂交育种的方法，可以提高菌种的生产能力。杂交育种的目的是将不同菌株的遗传物质进行交换、重组，使不同菌株的优良性状集中在重组体中，克服长期诱变引起的生活力下降等缺陷。杂交育种的一般程序为：选择原始亲本→诱变筛选直接亲本→直接亲本之间亲和力鉴定→杂交→分离到基本培养基或选择性培养基→筛选重组体→重组体分析鉴定。微生物杂交的程序如图2-6所示。

图2-6 微生物杂交的程序

大部分发酵工业中具有重要经济价值的微生物是准性生殖方式杂交重组。原核微生物杂交仅转移部分基因，然后形成部分结合子，最终实现染色体交换和基因重组。丝状真核微生物通过接合、染色体交换，然后分离形成重组体。常规杂交主要包括接合、转化、转导和转染等技术。

（三）原生质体融合育种

原生质体融合技术是在动植物细胞融合研究的基础上发展起来的，然后才应用于真菌、细菌和放线菌。由于这一技术可以打破种属间的界限，提高重组频率，扩大重组幅度，而备受关注。

原生质体融合的方法是先用酶酶解两个出发菌株的细胞壁，在高渗环境中释放出原生质，然后将它们混合，在助融剂或电场作用下，使它们互相凝集，最后发生细胞融合，实现遗传重组。一般包括原生质体制备，原生质体融合，原生质体再生和融合子筛选等步骤。微生物原生质体融合的一般原理和过程如图2-7所示。

图2-7 微生物原生质体融合的一般原理和过程(www.xing528.com)

在高渗溶液中，用适当的脱壁酶去除细胞壁，剩下的便是由细胞膜包裹的原生质体，去壁方法如表2-5所示。把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂PEG和Ca²⁺作用下，促进原生质体的融合。原生质体融合后，需再生，即重组子重建细胞壁，恢复完整细胞的生长和分裂。融合子的选择主要依靠两个亲株的选择性遗传标记。在选择性培养基上，通过两个亲株的遗传标记互补而挑选出融合子。在融合子再生后，经过几代自然分离、选择，才能确定优良性状融合子。

表2-5 原生质体制备时菌体去壁方法

续表

（四）基因工程育种

基因工程或称体外重组DNA技术、遗传工程，是现代生物技术的一个重要组成部分，为发酵工业提供了能生产巨大应用价值产品的生产菌株。基因工程一般包括：目标DNA片段的获得、与载体DNA分子的连接、重组DNA分子引入宿主细胞及从中选出含有所需重组DNA分子的宿主细胞。随着重组DNA技术的发展，将高等生物的基因克隆到大肠杆菌中，由大肠杆菌发酵生产人胰岛素、人生长激素和干扰素等高附加值药物产品已工业化生产。同时，在微生物发酵生产的其他产品中，重组DNA技术对产量的提高及性状的改良等也得到了广泛的研究和应用。用基因工程菌生产胰岛素的过程如图2-8所示。

图2-8 基因工程菌生产胰岛素过程示意图

基因工程菌最大的缺点就是因为传代时重组质粒丢失而造成的遗传不稳定，从而导致工程菌发酵生产时产量不稳定。

难点透析 适应性进化

适应性进化，通常也称为菌种驯化，一般是指通过人工措施使微生物逐步适应某一条件，而定向选育微生物的方法。通过驯化可以取得具有较高耐受力及活动能力的菌株。

目前实验室最常用的适应性进化方法是在特定条件（给予选择压力）下将微生物连续传代培养，通过菌株自发突变的不断富集，获得适应特定条件的表型或生理性能。在人工选育过程中，通过人工施加定向的选择压力，使微生物沿着所需的方向的进化，从而获得目标性状的菌种。适应性进化作为一种传统的菌种改良手段，在实际生产中有广泛应用，特别是在传统发酵、环境保护、金属冶炼等领域。例如，为了提高柠檬酸产生菌对高浓度柠檬酸的耐受力，可将该菌株在柠檬酸适应性进化培养基中进行耐酸性进化，柠檬酸浓度从低逐步提高，这样经过若干次传代后就能得到可耐高浓度柠檬酸的优良菌株。生物乙醇的生产中，副产物乙酸会严重抑制乙醇的生产，Peter Steiner等人将不耐受乙酸的野生型菌株进行适应性进化实验，将逐渐提高浓度的乙酸作为选择压力，经过240代的适应性进化，获得了能够耐受50g/L浓度乙酸的菌株。