重要工业微生物的分离筛选方法

工业微生物产生菌的筛选一般包括两部分：一是从自然界分离所需要的菌株；二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。

（一）菌种标本的采集

土壤是微生物的温床，土壤样品往往是首选的采集目标。采样时，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的容器内，编号并做好记录。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。

另外，有些要根据微生物生理特点进行采样。例如，在筛选果胶酶产生菌时，由于柑橘、草莓及山楂等果蔬中含有较多的果胶，因此，从上述样品的腐烂部分及果园土中采样较好。筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品，分离耐高渗透压酵母菌时，由于其偏爱糖分高、酸性的环境，一般在土壤中分布很少，因此，通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样。

（二）样品的预处理

为提高菌种分离的效果，在分离之前，对采集到的含微生物的样品要进行预处理，其处理方法如表2-1所示。

表2-1 含微生物的样品预处理方法

一般将采集到的带菌标本做加热处理，可杀死材料中的营养体，使孢子或耐热高温菌存活分离，用滤膜过滤可使水中或空气中的菌株相对集中。诱饵技术是将诱发材料置于土壤或水域等环境中，使有关菌株富集在上面以便于分离。

（三）富集培养

富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一定的限制性因素（如选择性培养基、特定培养条件、添加抑制剂或促进剂等），使目的微生物在最适的环境下迅速生长繁殖，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。

1. 控制培养基的营养成分

在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相应的底物作唯一碳源或氮源。那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖，其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。如分离放线菌的几种培养基如表2-2所示。

表2-2 分离放线菌的几种培养基

2. 控制培养条件

在筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效分离的目的。如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（pH7.0～7.5），霉菌和酵母菌要求偏酸（pH4.5～6.0）。因此，把富集培养基的pH调节到被分离微生物要求的范围内，不仅有利于自身生长，也可排除一部分不需要的菌类。分离放线菌时，可将样品液在40℃恒温预处理20min，有利于孢子的萌发，可以较大地增加放线菌数目；而分离芽孢杆菌时，可将样品液在80℃恒温预处理20min，杀死不产芽孢的菌种后再进行分离。

3. 抑制不需要的杂菌

通过高温、高压、添加抗生素等抑制其他微生物杂菌的生长。在选择性培养基中，也经常采用加入抗生素或抑制剂来增加其选择性，如表2-3所示。

表2-3 培养基中加入抗生素（抑制剂）及分离菌

（四）纯种分离

经富集培养后的样品中，目的微生物得以增殖，占有一定优势，其他种类微生物在数量上相对减少，但并未死亡。因此，富集后的培养液中仍然有多种微生物存在。

稀释涂布法和划线分离法是微生物学中常见的两种分离方法。稀释涂布法，在平板培养基上得到单菌落的机会较大，特别适合于分离易蔓延的微生物。划线分离法操作简便、快捷，效果较好。此外，菌种分离还有其他一些常见方法。

1. 利用平皿的生化反应进行快速分离

平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化。实际上是指每个菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物在平板上表现出的一些容易观察判断的生理反应，其大小表示菌株生产能力的大小。微生物特异性平板检测项目和方法如表2-4所示。

表2-4 微生物特异性平板检测项目和方法（酶为胞外酶）

平皿快速检测法有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，具体如图2-1所示。这些方法常用于初筛的定性或半定量用，可以大大提高筛选的效率。缺点是由于平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，往往会造成两者结果的不一致。

图2-1 平皿快速检测法示意图(www.xing528.com)

（1）纸片培养显色法 将饱浸有固体培养基（含有某种指示剂）的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放一小块浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后用接种环接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂，也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。这种方法适用于多种生理指标的测定，如氨基酸显色圈（转印到滤纸上再用茚三酮），柠檬酸变色圈（用0.02%溴甲酚蓝指示剂）等。

（2）透明圈法 在平板培养基中加入溶解性较差的底物，如可溶性淀粉、碳酸钙等，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，透明圈的大小初步反映该菌株利用底物的能力。

该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶等产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。酪蛋白培养基产生的透明圈如图2-2所示。分离产生有机酸的菌株时，在培养基中加入碳酸钙，将样品悬液涂抹到平板上培养，产酸菌产生的有机酸能把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈，从而轻易地鉴别出来。

图2-2 酪蛋白培养基产生的透明圈

（3）变色圈法 将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应，如图2-3所示。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。筛选果胶酶产生菌时，用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。

图2-3 以淀粉为碳源的培养基产生的变色圈

（4）生长圈法 是根据指示菌（或称工具菌）在目的菌周围形成生长圈而对目的菌进行检出。生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。指示菌通常是某种生长因子的营养缺陷型。将某待检菌涂布于含有高浓度的指示菌并缺少该指示菌生长所需营养因子的平板上进行培养，若某菌能合成指示菌所需的生长因子，指示菌就会在该菌的菌落周围形成一生长圈。

（5）抑菌圈法 抑菌圈法是常用的初筛方法，常用于抗生素产生菌的分离筛选，指示菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成指示菌不能生长的抑菌圈，从而使被检菌很容易被鉴别出来。

图2-4 牛津杯滴样得到的抑菌圈

具体操作：将溶化的固体培养基与被测定微生物混合做成平板，把含不等量被测物质的液体滴入平板上（直接滴样法）；或注入平板上的牛津杯内（管碟法，见图2-4）；或吸入圆形滤纸片后，再置于平板上（纸片法，见图2-5）；也可以在平板上挖一定大小的圆孔，然后把被测物滴入孔内（打孔法）。经培养后，在物质扩散所及的范围内出现抑菌法（或生长圈），测量圈的直径，并与标准曲线对比，可以计算出被测物质的含量。

图2-5 滤纸片法形成的抑菌圈示意图

1—滤纸片 2—细菌生长区 3—抑菌区

2. 组织分离法

组织分离法是从一些有病组织或特殊组织中分离菌株的方法。如从患恶苗病的水稻组织中分离赤霉菌，从根瘤中分离根瘤菌，从植物组织中分离内生真菌，以及从各种食用菌的子实体中分离孢子等。

（五）野生型菌株的筛选

在目的菌株分离的基础上，进一步通过筛选，选择具有目的产物合成能力相对高的菌株。一般分为初筛和复筛两步。

1. 初筛

初筛是从大量分离到的微生物中将具有合成目的产物的微生物筛选出来的过程。初筛可以分为两种情况进行。

（1）平板筛选 出发菌株多，工作量大，为了提高初筛的效率，可采用先采用平皿快速检测法，通过测量不同类型的反应圈直径与菌落直径之比，作为某菌株代谢产物量的“形态”指标。其最大的优点就是简便、快速，因而在筛选工作量大时具有相当的优越性；该法的不足之处是产物活性只能相对比较，难以得到确切的产量水平，只适用于初筛。

（2）摇瓶发酵筛选 由于摇瓶振荡培养更接近于发酵罐培养的条件，效果比较一致，由此筛选到的菌株易于推广；因此，经过平板定性筛选的菌种可以进行摇瓶培养。一般一个菌株接一个瓶，在一定转速的摇瓶机上及适宜的温度下振荡培养，得到的发酵液进行定性或定量测定。

初筛可淘汰85%～90%不符合要求的微生物，剩下较好的菌株则需进行摇瓶培养复筛。

2. 复筛

一般通过摇瓶或台式发酵罐进行液体培养，再对培养液进行分析测定，才能逐步地筛选出高产菌株。摇瓶（发酵罐）复筛是经过初筛得到的较优良菌株进一步复证，考察其产量性状的稳定性，从中再淘汰一部分不稳定的、相对产量低的或某些遗传性状不良的菌株。复筛时，一个菌株通常要重复3～5个瓶。

（六）野生型菌株的鉴定

经典分类鉴定方法主要根据形态学特征、生理生化特征、血清学试验和噬菌体分型等。现代分类鉴定方法主要是利用分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物的筛选方面发挥了着越来越重要的作用，如微生物遗传型鉴定（DNA碱基组成分析、DNA-DNA杂交、16S rRNA同源性分析、以DNA为基础的分型方法等）；另外，还有细胞化学成分特征分类法。