探究酶性质及影响反应速度的因素：温度、pH、激活剂和抑制剂

（1）掌握酶的性质与测定影响酶促反应速度因素的原理。

（2）熟悉酶在食品加工中的使用时对酶促反应速度的控制方法。

酶的化学本质是蛋白质。凡是能够引起蛋白质变性的因素，都可以使酶丧失活力。此外，温度、pH及激活剂与抑制剂对酶的活力都有显著的影响。

酶的活力通常是用测定酶作用的底物——淀粉被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察该酶在各环境条件下的活力。淀粉被酶水解的变化，可通过遇碘呈不同颜色来观察。淀粉遇碘呈蓝色；糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。

脲酶能催化尿素水解生成氨和二氧化碳，氨可与奈斯勒试剂作用生成橙红色化合物，由颜色深浅可判断反应进行的程度。

1. 实验试剂

（1）0.5%淀粉溶液 称取可溶性淀粉0.5 g，加蒸馏水少许，搅拌成糊状后，用煮沸的1%氯化钠溶液稀释至100 mL。

（2）碘化钾-碘溶液 取碘化钾2 g及碘1.27 g溶解于200 mL蒸馏水中，使用前用蒸馏水稀释5倍。

（3）1%尿素溶液。

（4）奈斯勒试剂贮存液 于100mL锥形瓶中加入碘化钾30g、碘22g、汞30g及蒸馏水20mL。用力振荡7～15min，到碘的颜色开始转变时，此混合液即发生高温，随即将此瓶浸于冷水中继续振荡，直到棕红色的碘转变成带绿色的碘化钾汞溶液为止。将上清液倒入400mL棕色容量瓶内，加蒸馏水至刻度后，混匀备用。

（5）奈斯勒试剂应用液 取10%氢氧化钠溶液700mL、奈斯勒试剂贮存液150mL及蒸馏水150mL混匀即可，如有混浊，可静置一日，取上清液使用。奈氏试剂是含有大量汞盐的强碱性溶液，所以它是具有腐蚀性的剧毒试剂，实验时必须严格遵守操作规程，谨防中毒。

（6）1%硫酸铜溶液 称取CuSO₄·5H₂O 1 g，用蒸馏水溶解稀释至100mL。

（7）磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH为5.0～8.0）。

①0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液：称取35.62g的Na₂HPO₄·2H₂O，用蒸馏水溶解后，定容至1000 mL。

②0.1 mol/L柠檬酸溶液：称取19.21 g无水柠檬酸，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL。

将①、②两液配制成pH5.0、pH6.8、pH7.4、pH8.0的溶液各10mL。

（8）0.5%氯化钠溶液。

（9）唾液淀粉酶制备 每人用自来水漱口1次，然后取20 mL蒸馏水含于口中，半分钟后吐入烧杯中，取10mL，稀释至20mL为稀释唾液，供实验用。

（10）脲酶提取液 取黄豆粉6g，加30%乙醇250mL，振摇10min，过滤，滤液供实验用。

2. 实验器材

恒温水浴锅、比色盘、容量瓶、试管与吸管、漏斗与烧杯。

1. 温度对酶活力的影响(www.xing528.com)

（1）淀粉酶的观察

①取3支大试管，编号后按表14-8操作。

表14-8 各试管溶液组成

②在白色比色盘上，滴碘液2滴于各孔中，自试管放入水浴后，每隔1 min，从第2管中取反应液1滴与碘液混合，观察颜色的变化。

③待第2管中反应液遇碘不发生颜色变化（即呈碘的颜色）时，向各管中加入碘液1滴，摇匀，观察并记录各管颜色，说明温度对酶活力的影响。

（2）脲酶的观察

①取4支试管，编号，于各管中加入脲酶液各1 mL。

②将第1管置于冰浴中，第2管置于室温，第3管置于50℃水浴中，第4管置于沸水浴中，5 min后取出。

③迅速向各管中加入1%尿素液1.0mL，摇匀，再迅速放入上述各自水浴中，准确保温10min。

④10min后，各管加入奈斯勒试剂5滴，摇匀，比较各管颜色的深浅，说明温度对脲酶活力的影响。

2. pH对酶活力的影响

（1）观察pH为6.8对酶活力的影响 取试管1支，加入pH为6.8的磷酸缓冲液3mL及0.5%淀粉溶液2mL，混匀。放置于37℃水浴中保温3min。再加入稀释唾液2mL混匀，继续保温，每隔1 min取出1滴于比色盘上，加碘液1滴，观察淀粉水解的程度，直至碘不变色，记下保温时间。

（2）观察不同pH对酶活力的影响 另取试管5支，编号，按编号顺序分别加入pH为5.0、6.2、6.8、7.4、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液3mL，每管加入0.5%淀粉溶液2mL。置37℃水浴中保温3min后，以1 min的间隔，依次向1～5号管中加入稀释唾液2mL，摇匀，37℃保温。参照上述第一步实验的保温时间，到时迅速取出，并立即加入碘液2滴，充分摇匀，观察各管呈现的颜色，判断在不同pH中淀粉水解的程度。可以看出pH对唾液淀粉酶活力的影响，并确定最适pH。

3. 酶的激活剂及抑制剂对酶活力的影响

（1）取小试管3支按表14-9操作。

（2）将3支试管放入37℃水浴中，并在白色比色盘上用碘液检查第2管，待碘液不变色时，向各管加碘液1滴，观察水解情况，记录并观察结果。

表14-9 各试管溶液组成

（1）稀释唾液加入时应迅速，其中要放入沸水浴的一管，当唾液加入后应立即放入沸水浴。

（2）酶的最适pH受缓冲液性质的影响。例如，唾液淀粉酶的最适pH为6.8，但在磷酸缓冲液中，其最适pH为6.4～6.6，在醋酸缓冲液中则为5.6。

（3）硫酸铜溶液为唾液淀粉酶的抑制剂。

（4）氯化钠溶液为唾液淀粉酶的激活剂。激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。例如，氯化钠到1 /3饱和度时就抑制唾液淀粉酶的活力。