如何准确测定饮料中的咖啡因含量？

1.紫外分光光谱法

（1）原理 咖啡因的三氯甲烷溶液在276.5nm波长下有最大吸收，其吸收值的大小与咖啡因溶液成正比，从而可进行定量。

（2）仪器与试剂

1）仪器：紫外分光光度计。

2）试剂：无水硫酸钠、三氯甲烷（使用前重新蒸馏）。其他试剂如下：

①15g/L高锰酸钾溶液：称取1.5g高锰酸钾，用水溶解并稀释至100mL。

②亚硫酸钠和硫氰酸钾混合溶液：称取10g无水亚硫酸钠（Na₂SO₃），用水溶解并稀释至100mL，另取10g硫氰酸钾，用水溶解并稀释至100mL，然后将二者均匀混合。

③15%磷酸溶液：吸取15mL磷酸置于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。

④200g/L氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠，用水溶解，冷却后稀释至100mL。

⑤200g/L乙酸锌溶液：称取20g乙酸锌[Zn（CH₃COO）2·2H₂O]加入3mL冰乙酸，加水溶解并稀释至100mL。

⑥100g/L亚铁氰化钾溶液：称取10g亚铁氰化钾[K₄Fe（CN）6·3H₂O]用水溶解并稀释至100mL。

⑦咖啡因标准品：含量在98.0%以上。

⑧咖啡因标准储备液：根据咖啡因标准品的含量用重蒸三氯甲烷配制成每毫升相当于0.5mg咖啡因的溶液，置于冰箱中保存。

（3）操作步骤

1）试样的制备

①可乐型饮料：在250mL的分流漏斗中，准确移入10.0～20.0mL经超声脱气后的均匀可乐型饮料试样，加入5mL15g/L高锰酸钾溶液，摇匀，静置5min，加入混合溶液10mL，摇匀，加入50mL重蒸三氯甲烷，振摇100次，静止分层，收集三氯甲烷。水层再加入40mL重蒸三氯甲烷，振摇100次，静置分层。合并二次三氯甲烷萃取液，并用重蒸三氯甲烷定容至100mL，摇匀，备用。

②咖啡、茶叶及其固体试样：在100mL烧杯中称取经粉碎成大小低于30目的均匀试样0.5～2.0g，加入80mL沸水，加盖，摇匀，浸泡2h，然后将浸出液全部移入100mL容量瓶中，加入2mL200g/L乙酸锌溶液，加入2mL100g/L亚铁氰化钾溶液，摇匀，用水定容至100mL，摇匀，静置沉淀，过滤。取滤液5.0～20.0mL按可乐型饮料操作进行，制备成100mL三氯甲烷溶液，备用。

③咖啡或茶叶的液体试样：在100mL容量瓶中准确移入10.0～20.0mL均匀试样，加入2mL200g/L乙酸锌溶液，摇匀，加入2mL100g/L亚铁氰化钾溶液，摇匀，用水定容至100mL，摇匀，静置沉淀，过滤。取滤液5.0～20.0mL按可乐型饮料操作进行，制备成100mL三氯甲烷溶液，备用。

2）标准曲线的绘制：从0.5mg/mL的咖啡因标准储备液中，用重蒸三氯甲烷配制成质量浓度分别为0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL的标准系列溶液，以0μg/mL溶液作参比管，调节零点，用1cm比色杯于276.5nm下测量吸光度，作吸光度-咖啡因含量的标准曲线或求出直线回归方程。

3）测定：在25mL具塞试管中，加入5g无水硫酸钠，倒入20mL试样的三氯甲烷制备液，摇匀，静置。将澄清的三氯甲烷用1cm比色杯于276.5nm测出其吸光度，根据标准曲线（直线回归方程）求出样品的吸光度，相当于咖啡因的质量浓度c（_μg/mL），同时用重蒸三氯甲烷作试剂空白。

（4）结果计算

式中 X₁——可乐型饮料中咖啡因的含量（mg/L）；

X₂——咖啡、茶叶及其固体试样中咖啡因的含量（mg/100g）；

X₃——咖啡、茶叶及其液体制品中咖啡因的含量（mg/L）；

c——试样吸光度相当于咖啡因的质量浓度（μg/mL）；

c₀——试剂空白吸光度相当于咖啡因的质量浓度（_μg/mL）；

m——称取试样的质量（g）；

V——移取试样的体积（mL）；

V₁——移取试样处理后水溶液的体积（mL）。

（5）精密度 对于可乐型饮料，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%；对于咖啡、茶叶及其制品，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。

紫外法检出限：可乐型饮料为3mg/L，咖啡、茶叶及其固体制品为5mg/100g，对咖啡和茶叶的液体制品为5mg/L。

2.高效液相色谱法（HPLC）

（1）原理 咖啡因的甲醇液在286nm波长下有最大吸收，其吸收值与咖啡因浓度成正比，从而可进行定量。

（2）仪器与试剂

1）仪器：液相色谱、色谱柱Bondapak C₁₈（30cm×3.9mmid）、预柱RESAVEC₁₈、超声清洗器（CQ250）、混纤微孔滤膜。

2）试剂：甲醇（HPLC试剂）、乙腈（HPLC试剂）、三氯甲烷（分析纯，必要时需重蒸）、超纯水（18.2MΩ）、无水硫酸钠（分析纯）、氯化钠（分析纯）、咖啡因标准品（纯度在98%以上）。

（3）操作步骤

1）试样的制备

①可乐型饮料：试样先用超声清洗器在40℃下超声5min脱气。取脱气试样10.0mL，通过混纤微孔滤膜过滤，弃去5mL初滤液，保留后5mL备用。

②咖啡、茶叶及其制成品：称取2g已经粉碎且粒度小于30目的均匀试样或液体试样放入150mL烧杯中，先加2～3mL超纯水，再加50mL三氯甲烷，摇匀，在超声处理机上萃取1min（30s二次），静置30min，分层。将萃取液倾入另一150mL的烧杯中，在试样中再加50mL三氯甲烷，重复上述萃取操作步骤，弃去试样，合并二次萃取液，加入少许无水硫酸钠和5mL饱和氯化钠，过滤，滤入100mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至100mL，最后取10mL滤液按上述操作进行。

2）色谱条件

①流动相：（57+29+14）甲醇-乙腈-水溶液（每升流动相中加入0.8mol/L乙酸液50mL）。

②流动相的流速：1.5mL/min。(www.xing528.com)

③进样量：可乐型饮料10μL，茶叶、咖啡及其制成品5～20μL。

3）标准曲线的绘制：用甲醇配制成咖啡因质量浓度分别为0μL/mL、20μL/mL、50μL/mL、100μL/mL、150μL/mL的标准系列溶液，然后分别进样10μL于286nm测量峰面积，作峰面积-咖啡因质量浓度的标准曲线或求出直线回归方程。

4）测定：从试样中吸取可乐饮料10μL或咖啡、茶叶及其制品10μL进样，于286nm处测其峰面积，然后根据标准曲线（或直线回归方程）得出试样的峰面积相当于咖啡因的浓度c（μg/mL）。同时做试剂空白试验。

（4）结果计算 可乐型饮料中咖啡因含量（mg/L）=c

咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因的含量（mg/100g）=c×V×100/（m×1000） （3-2-40）

式中 c——由标准曲线求得试样稀释液中咖啡因的质量浓度（μg/mL）；

V——试样定容体积（mL）；

m——试样质量（g）。

精密度：对于可乐型饮料，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%；对于咖啡、茶叶及其制品，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

HPLC法检出限：可乐型饮料为0.72mg/L；茶叶、咖啡及其制品为1.8mg/100g。

式中 X₁——可乐型饮料中咖啡因的含量（mg/L）；

X₂——咖啡、茶叶及其固体试样中咖啡因的含量（mg/100g）；

X₃——咖啡、茶叶及其液体制品中咖啡因的含量（mg/L）；

c——试样吸光度相当于咖啡因的质量浓度（μg/mL）；

c₀——试剂空白吸光度相当于咖啡因的质量浓度（_μg/mL）；

m——称取试样的质量（g）；

V——移取试样的体积（mL）；

V₁——移取试样处理后水溶液的体积（mL）。

（5）精密度 对于可乐型饮料，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%；对于咖啡、茶叶及其制品，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。

紫外法检出限：可乐型饮料为3mg/L，咖啡、茶叶及其固体制品为5mg/100g，对咖啡和茶叶的液体制品为5mg/L。

2.高效液相色谱法（HPLC）

（1）原理 咖啡因的甲醇液在286nm波长下有最大吸收，其吸收值与咖啡因浓度成正比，从而可进行定量。

（2）仪器与试剂

1）仪器：液相色谱、色谱柱Bondapak C₁₈（30cm×3.9mmid）、预柱RESAVEC₁₈、超声清洗器（CQ250）、混纤微孔滤膜。

2）试剂：甲醇（HPLC试剂）、乙腈（HPLC试剂）、三氯甲烷（分析纯，必要时需重蒸）、超纯水（18.2MΩ）、无水硫酸钠（分析纯）、氯化钠（分析纯）、咖啡因标准品（纯度在98%以上）。

（3）操作步骤

1）试样的制备

①可乐型饮料：试样先用超声清洗器在40℃下超声5min脱气。取脱气试样10.0mL，通过混纤微孔滤膜过滤，弃去5mL初滤液，保留后5mL备用。

②咖啡、茶叶及其制成品：称取2g已经粉碎且粒度小于30目的均匀试样或液体试样放入150mL烧杯中，先加2～3mL超纯水，再加50mL三氯甲烷，摇匀，在超声处理机上萃取1min（30s二次），静置30min，分层。将萃取液倾入另一150mL的烧杯中，在试样中再加50mL三氯甲烷，重复上述萃取操作步骤，弃去试样，合并二次萃取液，加入少许无水硫酸钠和5mL饱和氯化钠，过滤，滤入100mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至100mL，最后取10mL滤液按上述操作进行。

2）色谱条件

①流动相：（57+29+14）甲醇-乙腈-水溶液（每升流动相中加入0.8mol/L乙酸液50mL）。

②流动相的流速：1.5mL/min。

③进样量：可乐型饮料10μL，茶叶、咖啡及其制成品5～20μL。

3）标准曲线的绘制：用甲醇配制成咖啡因质量浓度分别为0μL/mL、20μL/mL、50μL/mL、100μL/mL、150μL/mL的标准系列溶液，然后分别进样10μL于286nm测量峰面积，作峰面积-咖啡因质量浓度的标准曲线或求出直线回归方程。

4）测定：从试样中吸取可乐饮料10μL或咖啡、茶叶及其制品10μL进样，于286nm处测其峰面积，然后根据标准曲线（或直线回归方程）得出试样的峰面积相当于咖啡因的浓度c（μg/mL）。同时做试剂空白试验。

（4）结果计算 可乐型饮料中咖啡因含量（mg/L）=c

咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因的含量（mg/100g）=c×V×100/（m×1000） （3-2-40）

式中 c——由标准曲线求得试样稀释液中咖啡因的质量浓度（μg/mL）；

V——试样定容体积（mL）；

m——试样质量（g）。

精密度：对于可乐型饮料，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%；对于咖啡、茶叶及其制品，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

HPLC法检出限：可乐型饮料为0.72mg/L；茶叶、咖啡及其制品为1.8mg/100g。