1.原理
样品中还原型抗坏血酸（维生素C）经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺反应生成有荧光的化合物（喹唔啉），其荧光强度与抗坏血酸的含量成正比，在激发波长338nm和发射波长420nm处测定。
2.仪器与试剂
（1）仪器 荧光分光光度计、捣碎机实验室常用设备。
（2）试剂
1）邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至100mL。
2）偏磷酸-乙酸溶液：称取15g偏磷酸，加入40mL冰乙酸及250mL水，加热，搅拌，使之逐渐溶解，冷却后加水至500mL，于4℃的冰箱中可保存7～10天。
3）0.15mol/L硫酸：取10mL硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200mL。
4）偏磷酸-乙酸-硫酸溶液：以0.15mol/L硫酸液为稀释液，其余同偏磷酸-乙酸溶液的配制。
5）500g/L乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠（CH2COONa·3H2O），加水至1000mL。
6）硼酸-乙酸钠溶液：称取3g硼酸，溶于100mL乙酸钠溶液（500g/L）中，临用前配制。
7）1mg/mL抗坏血酸标准溶液（临用前配制）：准确称取50mg抗坏血酸，用偏磷酸-乙酸溶液溶于50mL容量瓶中，并稀释至刻度。
8）100μg/mL抗坏血酸标准使用液：取10mL抗坏血酸标准溶液，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100mL。定容前测pH值，若其pH值大于2.2，则应用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释。
9）0.04%百里酚蓝指示剂：称取0.1g百里酚蓝，加0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75mL，磨溶后用水稀释至250mL。变色范围：pH=1.2时为红色，pH=2.8时为黄色，pH＞4时为蓝色。
10）活性炭的活化：取200g活性炭（粉状），加入1000mL（1+9）盐酸溶液，加热回流1～2h后过滤，用水洗至滤液中无铁离子（用硫氰酸盐确证有无铁离子存在）为止，置于110～120℃烘箱中干燥，备用。
3.操作步骤
1）样品液的制备：称取适量匀样（试样中抗坏血酸的质量浓度为40～100μg/mL）置于100mL容量瓶中，加入等量的偏磷酸-乙酸溶液，用0.04%百里酚蓝指示剂调试样品酸碱度，若呈红色，则可用偏磷酸-乙酸溶液稀释；若呈黄色或蓝色，则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释，使pH=1.2，并用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100mL。
2）氧化处理：分别取样品液及标准使用液各100mL置于200mL带盖锥形瓶中，加2g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初几毫升滤液，收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准氧化液，待测定。
3）各取10mL标准氧化液置于2个100mL容量瓶中，分别标明“标准”及“标准空白”。
4）各取10mL样品氧化液置于2个100mL容量瓶中，分别标明“试样”及“试样空白”。
5）在“标准空白”和“试样空白”溶液中各加5mL硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至100mL，在4℃冰箱中放置2～3h，取出备用。
6）于“试样”及“标准”溶液中各加入5mL乙酸钠溶液（500g/L），用水稀释至100mL，备用。(www.xing528.com)
7）标准曲线的绘制：分别取上述“标准”溶液（抗坏血酸质量浓度为10μg/mL）0.5mL、1.0mL、1.5mL和2.0mL，各取双份分别置于10mL带盖试管中，再用水补充至2.0mL。荧光反应按下述操作进行。
8）荧光反应：取5）中“标准空白”和“试样空白”溶液及6）中“样品”和“试样”溶液各2mL，分别置于10mL带盖试管中，在暗室内迅速向各管中加入5mL邻苯二胺溶液，振摇混合，在室温下反应35min，于激发波长338nm、发射波长420nm处测定荧光强度。将标准系列溶液的荧光强度分别减去标准空白荧光强度作为纵坐标，将对应的抗坏血酸含量作为横坐标，绘制标准曲线，或进行直线回归方程计算。
4.结果计算
抗坏血酸的含量按式（3-2-27）计算。
式中 X——试样中抗坏血酸的含量（mg/100g）；
m——试样的质量（g）；
c——由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液的质量浓度（μg/mL）；
V——参加荧光反应的所有试样的体积（mL）；
F——试样溶液的稀释倍数。
5.注意事项
试样中有其他荧光物质的干扰，可通过加入硼酸，使脱氢抗坏血酸形成复合物，它不与邻苯二胺生成荧光化合物，从而测出其他荧光杂质作为空白荧光强度加以校正。
允许差：同一样品同时或连续两次测定结果的绝对差值应小于或等于算术平均值的10%，取两次测定的平均值作为结果，精确到小数点后第一位。
式中 X——试样中抗坏血酸的含量（mg/100g）；
m——试样的质量（g）；
c——由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液的质量浓度（μg/mL）；
V——参加荧光反应的所有试样的体积（mL）；
F——试样溶液的稀释倍数。
5.注意事项
试样中有其他荧光物质的干扰，可通过加入硼酸，使脱氢抗坏血酸形成复合物，它不与邻苯二胺生成荧光化合物，从而测出其他荧光杂质作为空白荧光强度加以校正。
允许差：同一样品同时或连续两次测定结果的绝对差值应小于或等于算术平均值的10%，取两次测定的平均值作为结果，精确到小数点后第一位。
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