金黄色葡萄球菌测定技能训练2：裱花蛋糕奶油装饰料

1.原理

金黄色葡萄球菌是人类的一种病原菌，隶属于葡萄球菌属，有“嗜肉菌”的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染，被列为致病菌。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，在空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因此，食品受其污染的机会很多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品等常被其污染。

裱花蛋糕中的奶油装饰料因其由鲜奶经搅打充气而来，极易受到金黄色葡萄球菌的污染，并且充气奶油在冷藏后，可再次被搅打充气使用，污染不易被发现。因此，在生产中，金黄色葡萄球菌的测定应作为裱花蛋糕中的奶油装饰料的质量控制点。在GB 7099—2003中要求糕点、面包中不得检出金黄色葡萄球菌。

2.仪器与试剂

（1）仪器 天平（感量为0.1g）、冰箱（温度为2～5℃）、恒温水浴箱（温度为37～65℃）、恒温培养箱（温度为36℃±1℃）、均质器、振荡器、无菌吸管（1mL，分度值为0.01mL；10mL，分度值为0.1mL；或微量移液器及吸头）、无菌锥形瓶（容量为100mL、500mL）、无菌培养皿（直径为90mm）、注射器（0.5mL）、pH计或pH比色管或精密pH试纸。

（2）试剂

1）10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤：将胰酪胨（或胰蛋白胨）17.0g、植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3.0g、氯化钠100.0g、磷酸氢二钾2.5g、丙酮酸钠10.0g、葡萄糖2.5g、蒸馏水1000mL混合，加热，轻轻搅拌并溶解，将pH值调为7.3±0.2，分装，每瓶225mL，于121℃高压灭菌15min。

2）7.5%氯化钠肉汤：将蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠75g、蒸馏水1000mL混合，加热溶解，将pH值调为7.4，分装，每瓶225mL，于121℃高压灭菌15min。

3）血琼脂平板：取豆粉琼脂（pH=7.4～7.6）100mL加热熔化，冷却至50℃，以无菌操作加入脱纤维羊血（或兔血）5～10mL，摇匀，倾注平板。

4）Baird-Parker琼脂平板：首先配制增菌剂（将30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL混合，保存于冰箱内备用），其次将胰蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、酵母膏1.0g、丙酮酸钠10.0g、甘氨酸12.0g、氯化锂（LiCl·6H2O）5.0g、琼脂20.0g加到950mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，将pH值调为7.0±0.2，分装，每瓶95mL，于121℃高压灭菌15min。临用平板时加热熔化琼脂，冷至50℃，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL，摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的，使用前在冰箱内储存不得超过48h。

5）脑心浸出液肉汤：将胰蛋白质胨10.0g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）2.5g、葡萄糖2.0g、牛心浸出液500mL加热溶解，调节pH=7.4±0.2，分装于16mm×160mm试管，每管5mL，于121℃灭菌15min。

6）兔血浆：取3.8%柠檬酸钠溶液一份（取3.8g柠檬酸钠，加蒸馏水100mL，溶解后过滤，过滤于121℃高压灭菌15min），加兔全血四份，混好静置（或以3000r/min离心30min），使血液细胞下降，即可得血浆。

7）营养琼脂小斜面：将蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、氯化钠5.0g溶解于1000mL蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，将pH值调为7.2～7.4，加入琼脂15.0～20.0g，加热煮沸，使琼脂溶化，分装于13mm×130mm管，于121℃高压灭菌15min。

8）磷酸盐缓冲液、革兰氏染色液、无菌生理盐水（称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水，于121℃高压灭菌15min）。

3.金黄色葡萄球菌定性检验程序

金黄色葡萄球菌定性检验流程如图3-2-6所示。(www.xing528.com)

图3-2-6 金黄色葡萄球菌定性检验流程

4.操作步骤

（1）样品的处理 称取25g裱花蛋糕奶油装饰料样品置于盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，以8000～10000r/min的转速均质1～2min，振荡混匀。

（2）增菌 将上述样品匀液于36℃±1℃培养18～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。

（3）分离培养 将上述培养物分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，在血平板上于36℃±1℃培养18～24h，在Baird-Parker平板上于36℃±1℃培养18～24h或45～48h。

金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上的菌落直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一条混浊带，在其外层有一个透明圈。用接种针接触菌落时有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡一些，外观可能粗糙并且干燥。在血平板上形成的菌落较大，为圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。

（4）鉴定

1）染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢，无荚膜，直径为0.5～1μm。

2）血浆凝固酶试验：挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或1个以上，分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，于36℃±1℃培养18～24h。

取新鲜配制的兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2～0.3mL，振荡摇匀，置于36℃±1℃恒温培养箱或水浴箱内，每0.5h观察一次，观察6h，若呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的1/2，则可判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。

若结果可疑，则挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI，于36℃±1℃培养18～48h，重复试验。

5.结果与报告

根据染色镜检、血浆凝固酶试验的鉴定结果，报告在25g样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。