黄曲霉毒素B1测定技能训练

1.原理

试样中的黄曲霉毒素B1经提取、浓缩、薄层分离后，在波长为365nm的紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。

2.仪器与试剂

（1）仪器 小型粉碎机、样筛、电动振荡器、全玻璃浓缩器、玻璃板（5cm×20cm）、薄层板涂布器、展开槽（内长为25cm，宽度为6cm，高度为4cm）、紫外光灯（功率为100～125W，带有波长为365nm的滤光片）、微量注射器或血色素吸管。

（2）试剂 三氯甲烷、正己烷或石油醚（沸程为30～60℃或60～90℃）、甲醇、苯、乙腈、无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水、丙酮，以上试剂在试验时先进行一次试剂空白试验，若不干扰测定则可使用，否则需逐一进行重蒸。硅胶G（薄层色谱用）、三氟乙酸、无水硫酸钠、氯化钠、苯-乙腈混合液（量取98mL苯，加2mL乙腈，混匀）、（55+45）甲醇水溶液。其他试剂如下：

1）黄曲霉毒素B1标准溶液

①仪器校正：测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素。准确称取25mg经干燥的重铬酸钾（基准级），用（0.5+1000）硫酸溶液溶解后准确稀释至200mL，相当于c（K₂Cr₂O₇）=0.0004mol/L。吸取25mL此稀释液置于50mL容量瓶中，加（0.5+1000）硫酸溶液稀释至刻度，相当于0.0002mol/L溶液。吸取25mL此稀释液置于50mL容量瓶中，加（0.5+1000）硫酸溶液稀释至刻度，相当于0.0001mol/L溶液。用1cm石英杯，在最大吸收峰的波长（接近350nm）处用（0.5+1000）硫酸溶液作空白，测得以上三种不同浓度的溶液的吸光度，并按式（3-2-6）计算出以上三种溶液的摩尔消光系数的平均值。

E₁=A/c （3-2-6）

式中 E₁——重铬酸钾溶液的摩尔消光系数；

A——测得重铬酸钾溶液的吸光度；

c——重铬酸钾溶液的浓度。

再以此平均值与重铬酸钾的摩尔消光系数值3160比较，即求出使用仪器的校正因素，按式（3-2-7）进行计算。

f=3160/E （3-2-7）

式中 f——使用仪器的校正因素；

E——测得的重铬酸钾摩尔消光系数的平均值。

若f大于0.95或小于1.05，则使用仪器的校正因素可忽略不计。

②黄曲霉毒素B1标准溶液的制备：准确称取1.0～1.2mg黄曲霉毒素B1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光，置于4℃的冰箱内保存。该标准溶液的质量浓度约为10μg/mL。用紫外分光光度计测此标准溶液的最大吸收峰的波长及该波长的吸光度。黄曲霉毒素B1标准溶液的质量浓度按式（3-2-8）计算。

式中 X——黄曲霉毒素B1标准溶液的质量浓度（μg/mL）；

A——测得的吸光度；

f——使用仪器的校正因素；

M——黄曲霉毒素B1的相对分子质量（312）；

E₂——黄曲霉毒素B1在苯-乙腈混合液中的摩尔消光系数（19800）。

根据计算，用苯-乙腈混合液调到标准溶液质量浓度恰为10.0μg/mL，并用分光光度计核对其质量浓度。

③纯度的测定：取5μL质量浓度为10μg/mL的黄曲霉毒素B1标准溶液，滴加于涂层厚度为0.25mm的硅胶G薄层板上，用（4+96）甲醇-三氯甲烷溶液与（8+92）丙酮-三氯甲烷展开剂展开，在紫外光灯下观察荧光的产生，应符合以下条件：在展开后，只有单一的荧光点，无其他杂质荧光点；原点上没有任何残留的荧光物质。

2）黄曲霉毒素B1标准使用液：准确吸取1mL黄曲霉毒素B1标准溶液（10μg/mL）置于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于1.0μg黄曲霉毒素B1；吸取1.0mL此稀释液，置于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度，此溶液每毫升相当于0.2μg黄曲霉毒素B1；吸取1.0mL黄曲霉毒素B1标准溶液（0.2μg/mL）置于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度，此溶液每毫升相当于0.04μg黄曲霉毒素B1。

3）次氯酸钠溶液（消毒用）：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均匀，另将80g工业用碳酸钠（Na₂CO₃·10H₂O）溶于500mL温水中，再将两液混合、搅拌，澄清后过滤。此滤液中次氯酸的质量浓度约为25g/L。若用漂粉精制备，则碳酸钠的量可以加倍，所得溶液的质量浓度约为50g/L。污染的玻璃仪器用10g/L次氯酸钠溶液浸泡半天或用50g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。

3.操作步骤

（1）取样 样品中一粒被黄曲霉毒素严重污染的霉粒即可以左右测定结果，并且有毒霉粒的比例小，分布也不均匀。为避免取样带来的误差，必须大量取样，并将样品粉碎，混合均匀，才有可能得到确实能代表一批样品的相对可靠的结果。因此采样时必须注意以下几点：

1）根据规定采取有代表性的样品。

2）检验局部发霉变质的样品时，应单独取样。

3）每份分析测定用的样品应从大样进行粗碎，再连续多次用四分法缩减至0.5～1kg，然后全部粉碎。原粮样品全部通过20目筛，混匀。花生样品全部通过10目筛，混匀，或将好、坏分别测定，再计算其含量。花生油和花生酱等样品不需制备，但取样时应搅拌均匀。必要时，每批样品可采取3份大样用于样品制备及分析测定，以观察所采样品是否具有一定的代表性。

（2）提取

1）玉米、大米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等

①甲法：称取20.00g粉碎过筛样品（面粉、花生酱不需粉碎），置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏，振荡30min，静置片刻，用叠成折叠式的快速定性滤纸将其过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液存于另一具塞锥形瓶内；取20.00mL甲醇水溶液（相当于4g样品）置于另一只125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层，若出现乳化现象，则可滴加甲醇促使分层；放出三氯甲烷层，用盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中，再向分液漏斗中加5mL三氯甲烷，重复振摇提取，将三氯甲烷层一并过滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，将洗液并于蒸发皿中；将蒸发皿放在通风柜内，于65℃水浴上通风吹干，然后放在冰盒上冷却2～3min后，准确加入1mL苯-乙腈混合液（或将三氯甲烷用浓缩蒸馏器减压吹气蒸干后，准确加入1mL苯-乙腈混合液），用带橡胶头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中。

②乙法（限于玉米、大米、小麦及其制品）。称取20.00g粉碎过筛的样品置于250mL具塞锥形瓶中，用滴管滴加约6mL水，使样品湿润，准确加入60mL三氯甲烷，振荡30min，加12g无水硫酸钠，振摇后，静置30min，用叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于100mL具塞锥形瓶中，取12mL滤液（相当于4g样品）置于蒸发皿中，在65℃水浴上通风吹干，准确加入1mL苯-乙腈混合液，以下按甲法中自“用带橡胶头的滴管的管尖将残渣充分混合”起操作。

2）花生油、香油、菜油等：称取4.00g样品置于小烧杯中，用20mL正己烷或石油醚将样品移于125mL分液漏斗中，用20mL甲醇水溶液分数次洗烧杯，将洗液一并移入分液漏斗中，振摇2min，静置分层后，将下层甲醇水溶液移入第二个分液漏斗中，再用5mL甲醇水溶液重复振摇提取一次，将提取液一并移入第二个分液漏斗中，在第二个分液漏斗中加入20mL三氯甲烷，以下按甲法中自“振摇2min，静置分层”起操作。

（3）测定

1）单向展开法

①薄层板的制备：称取约3g硅胶G，加相当于硅胶量2～3倍的水，用力研磨1～2min，待其成糊状后立即倒于涂布器内，推成面积为5cm×20cm，厚度约为0.25mm的薄层板三块。在空气中干燥约15min后，在100℃活化2h，取出，放干燥器中保存，一般可保存2～3天。若放置时间较长，则可再次活化后使用。

②点样：将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距约为1cm，点直径约为3mm。在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。滴加样式如下：

第一点：10μL黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04μg/mL）。

第二点：20μL样液。

第三点：20μL样液+10μL质量浓度为0.04μg/mL的黄曲霉毒素B1标准使用液。

第四点：20μL样液+10μL质量浓度为0.2μg/mL的黄曲霉毒素B1标准使用液。

③展开与观察：在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥发干，再于另一展开槽内加10mL（8+92）丙酮-三氯甲烷溶液，展开10～12cm，取出，在紫外光下观察结果，方法如下：

a.由于样液点上加滴了黄曲霉毒素B1标准使用液，因此可使黄曲霉毒素B1标准点与样液中的黄曲霉毒素B1荧光点重叠。如果样液为阴性，那么薄层板上的第三点中黄曲霉毒素B1的质量为0.0004μg，可用于检查在样液内黄曲霉毒素B1最低检出量是否正常出现；如果样液为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B1的质量为0.002μg，主要起定位作用。

b.若第二点在与黄曲霉毒素B1标准点的相应位置上无蓝色荧光点，则表示样品中黄曲霉毒素B1含量在5μg/kg以下；若在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需进行确证试验。

④确证试验：为了证实薄层板上样液荧光是由黄曲霉毒素B1产生的，加滴三氟乙酸，产生黄曲霉毒素B1的衍生物，展开后此衍生物的比移值约为0.1左右。于薄层板左边依次滴加两个点：第一点为10μL质量浓度为0.04μg/mL的黄曲霉毒素B1标准使用液；第二点为20μL样液。

于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风（使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃）2min后，再于薄层板上滴加第三和第四两个点：第三点为10μL质量浓度为0.04μg/mL的黄曲霉毒素B1标准使用液；第四点为20μL样液。

再次展开（同③），在紫外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素B1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。

⑤稀释定量：样液中的黄曲霉毒素B1荧光点的荧光强度如果与黄曲霉毒素B1标准点的最低检出量（0.0004μg）的荧光强度一致，则样品中黄曲霉毒素B1的含量即为5μg/kg。如果样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下：

第一点：10μL黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04μg/mL）。

第二点：根据情况滴加10μL样液。

第三点：根据情况滴加15μL样液。

第四点：根据情况滴加20μL样液。

4.结果计算(www.xing528.com)

试样中黄曲霉毒素B1的含量按式（3-2-9）计算。

式中 X——黄曲霉毒素B1标准溶液的质量浓度（μg/mL）；

A——测得的吸光度；

f——使用仪器的校正因素；

M——黄曲霉毒素B1的相对分子质量（312）；

E₂——黄曲霉毒素B1在苯-乙腈混合液中的摩尔消光系数（19800）。

根据计算，用苯-乙腈混合液调到标准溶液质量浓度恰为10.0μg/mL，并用分光光度计核对其质量浓度。

③纯度的测定：取5μL质量浓度为10μg/mL的黄曲霉毒素B1标准溶液，滴加于涂层厚度为0.25mm的硅胶G薄层板上，用（4+96）甲醇-三氯甲烷溶液与（8+92）丙酮-三氯甲烷展开剂展开，在紫外光灯下观察荧光的产生，应符合以下条件：在展开后，只有单一的荧光点，无其他杂质荧光点；原点上没有任何残留的荧光物质。

2）黄曲霉毒素B1标准使用液：准确吸取1mL黄曲霉毒素B1标准溶液（10μg/mL）置于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于1.0μg黄曲霉毒素B1；吸取1.0mL此稀释液，置于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度，此溶液每毫升相当于0.2μg黄曲霉毒素B1；吸取1.0mL黄曲霉毒素B1标准溶液（0.2μg/mL）置于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度，此溶液每毫升相当于0.04μg黄曲霉毒素B1。

3）次氯酸钠溶液（消毒用）：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均匀，另将80g工业用碳酸钠（Na₂CO₃·10H₂O）溶于500mL温水中，再将两液混合、搅拌，澄清后过滤。此滤液中次氯酸的质量浓度约为25g/L。若用漂粉精制备，则碳酸钠的量可以加倍，所得溶液的质量浓度约为50g/L。污染的玻璃仪器用10g/L次氯酸钠溶液浸泡半天或用50g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。

3.操作步骤

（1）取样 样品中一粒被黄曲霉毒素严重污染的霉粒即可以左右测定结果，并且有毒霉粒的比例小，分布也不均匀。为避免取样带来的误差，必须大量取样，并将样品粉碎，混合均匀，才有可能得到确实能代表一批样品的相对可靠的结果。因此采样时必须注意以下几点：

1）根据规定采取有代表性的样品。

2）检验局部发霉变质的样品时，应单独取样。

3）每份分析测定用的样品应从大样进行粗碎，再连续多次用四分法缩减至0.5～1kg，然后全部粉碎。原粮样品全部通过20目筛，混匀。花生样品全部通过10目筛，混匀，或将好、坏分别测定，再计算其含量。花生油和花生酱等样品不需制备，但取样时应搅拌均匀。必要时，每批样品可采取3份大样用于样品制备及分析测定，以观察所采样品是否具有一定的代表性。

（2）提取

1）玉米、大米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等

①甲法：称取20.00g粉碎过筛样品（面粉、花生酱不需粉碎），置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏，振荡30min，静置片刻，用叠成折叠式的快速定性滤纸将其过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液存于另一具塞锥形瓶内；取20.00mL甲醇水溶液（相当于4g样品）置于另一只125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层，若出现乳化现象，则可滴加甲醇促使分层；放出三氯甲烷层，用盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中，再向分液漏斗中加5mL三氯甲烷，重复振摇提取，将三氯甲烷层一并过滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，将洗液并于蒸发皿中；将蒸发皿放在通风柜内，于65℃水浴上通风吹干，然后放在冰盒上冷却2～3min后，准确加入1mL苯-乙腈混合液（或将三氯甲烷用浓缩蒸馏器减压吹气蒸干后，准确加入1mL苯-乙腈混合液），用带橡胶头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中。

②乙法（限于玉米、大米、小麦及其制品）。称取20.00g粉碎过筛的样品置于250mL具塞锥形瓶中，用滴管滴加约6mL水，使样品湿润，准确加入60mL三氯甲烷，振荡30min，加12g无水硫酸钠，振摇后，静置30min，用叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于100mL具塞锥形瓶中，取12mL滤液（相当于4g样品）置于蒸发皿中，在65℃水浴上通风吹干，准确加入1mL苯-乙腈混合液，以下按甲法中自“用带橡胶头的滴管的管尖将残渣充分混合”起操作。

2）花生油、香油、菜油等：称取4.00g样品置于小烧杯中，用20mL正己烷或石油醚将样品移于125mL分液漏斗中，用20mL甲醇水溶液分数次洗烧杯，将洗液一并移入分液漏斗中，振摇2min，静置分层后，将下层甲醇水溶液移入第二个分液漏斗中，再用5mL甲醇水溶液重复振摇提取一次，将提取液一并移入第二个分液漏斗中，在第二个分液漏斗中加入20mL三氯甲烷，以下按甲法中自“振摇2min，静置分层”起操作。

（3）测定

1）单向展开法

①薄层板的制备：称取约3g硅胶G，加相当于硅胶量2～3倍的水，用力研磨1～2min，待其成糊状后立即倒于涂布器内，推成面积为5cm×20cm，厚度约为0.25mm的薄层板三块。在空气中干燥约15min后，在100℃活化2h，取出，放干燥器中保存，一般可保存2～3天。若放置时间较长，则可再次活化后使用。

②点样：将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距约为1cm，点直径约为3mm。在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。滴加样式如下：

第一点：10μL黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04μg/mL）。

第二点：20μL样液。

第三点：20μL样液+10μL质量浓度为0.04μg/mL的黄曲霉毒素B1标准使用液。

第四点：20μL样液+10μL质量浓度为0.2μg/mL的黄曲霉毒素B1标准使用液。

③展开与观察：在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥发干，再于另一展开槽内加10mL（8+92）丙酮-三氯甲烷溶液，展开10～12cm，取出，在紫外光下观察结果，方法如下：

a.由于样液点上加滴了黄曲霉毒素B1标准使用液，因此可使黄曲霉毒素B1标准点与样液中的黄曲霉毒素B1荧光点重叠。如果样液为阴性，那么薄层板上的第三点中黄曲霉毒素B1的质量为0.0004μg，可用于检查在样液内黄曲霉毒素B1最低检出量是否正常出现；如果样液为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B1的质量为0.002μg，主要起定位作用。

b.若第二点在与黄曲霉毒素B1标准点的相应位置上无蓝色荧光点，则表示样品中黄曲霉毒素B1含量在5μg/kg以下；若在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需进行确证试验。

④确证试验：为了证实薄层板上样液荧光是由黄曲霉毒素B1产生的，加滴三氟乙酸，产生黄曲霉毒素B1的衍生物，展开后此衍生物的比移值约为0.1左右。于薄层板左边依次滴加两个点：第一点为10μL质量浓度为0.04μg/mL的黄曲霉毒素B1标准使用液；第二点为20μL样液。

于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风（使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃）2min后，再于薄层板上滴加第三和第四两个点：第三点为10μL质量浓度为0.04μg/mL的黄曲霉毒素B1标准使用液；第四点为20μL样液。

再次展开（同③），在紫外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素B1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。

⑤稀释定量：样液中的黄曲霉毒素B1荧光点的荧光强度如果与黄曲霉毒素B1标准点的最低检出量（0.0004μg）的荧光强度一致，则样品中黄曲霉毒素B1的含量即为5μg/kg。如果样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下：

第一点：10μL黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04μg/mL）。

第二点：根据情况滴加10μL样液。

第三点：根据情况滴加15μL样液。

第四点：根据情况滴加20μL样液。

4.结果计算

试样中黄曲霉毒素B1的含量按式（3-2-9）计算。

式中 X——试样中黄曲霉毒素B1的含量（μg/kg）；

V₁——加入苯-乙腈混合液的体积（mL）；

V₂——出现最低荧光时滴加样液的体积（mL）；

D——样液的总稀释倍数；

m——加入苯-乙腈混合液溶解时相当样品的质量（g）；

0.0004——黄曲霉毒素B1的最低检出量（μg）。

结果表示到测定值的整数位。

式中 X——试样中黄曲霉毒素B1的含量（μg/kg）；

V₁——加入苯-乙腈混合液的体积（mL）；

V₂——出现最低荧光时滴加样液的体积（mL）；

D——样液的总稀释倍数；

m——加入苯-乙腈混合液溶解时相当样品的质量（g）；

0.0004——黄曲霉毒素B1的最低检出量（μg）。

结果表示到测定值的整数位。