1.原理
食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生产硫酸铵，在pH值为4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中，与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3，5-二乙酰-2，6二甲基-1，4-二氢化吡啶化合物，在波长400nm下测定吸收度，与标准系列溶液比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
2.仪器与试剂
（1）仪器 分光光度计、电热恒温水浴锅（100℃±0.5℃）、天平（感量为1mg）、具塞玻璃比色管（10mL）。
（2）试剂 除非另有规定，所使用的试剂均为分析纯，水为GB/T6682—2008规定的三级水。硫酸铜（CuSO4·5H2O）、硫酸钾、硫酸（ρ=1.84g/L，优级纯）、硼酸溶液（20g/L）、氢氧化钠溶液（300g/L）、对硝基苯酚、乙酸钠（CH3COONa·3H2O）、无水乙酸钠、乙酸（优级纯）、37%甲醛、乙酰丙酮。其他试剂如下：
1）对硝基苯酚指示剂溶液（1g/L）：称取0.1g对硝基苯酚指示剂溶于20mL体积分数为95%的乙醇中，加水稀释至100mL。
2）乙酸溶液（1mol/L）：量取5.8mL乙酸，加水稀释至100mL。
3）乙酸钠溶液（1mol/L）：称取41g无水乙酸钠或68g乙酸钠，加水溶解后稀释至500mL。
4）乙酸钠-乙酸缓冲溶液：量取60mL乙酸钠溶液和40mL乙酸溶液混合，该溶液pH=4.8。
5）显色剂：15mL甲醛与7.8mL乙酰丙酮混合，加水稀释至100mL，剧烈振摇混匀（室温下放置可稳定三天）。
6）氨氮标准储备溶液（以氮计，1.0g/L）：称取于105℃干燥2h的硫酸铵0.4720g，加水溶解后移入100mL容量瓶中，稀释至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于1.0mg氮。
7）氨氮标准使用溶液（0.1g/L）：用移液管吸取10.00mL氨氮标准储备液置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于0.1mg氮。
3.操作步骤
（1）试样的消解 称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1～0.5g（精确至0.001g）、半固体试样0.2～1g（精确至0.001g）或液体试样1～5g（精确至0.001g），移入干燥的100mL或250mL定氮瓶中，加入0.1g硫酸铜、1g硫酸钾及5mL硫酸，摇匀后于瓶口放一支漏斗，将定氮瓶以45°斜支于有小圆孔的石棉网上，小心加热，待内容物全部炭化、泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h，取下放冷，慢慢加入20mL水，放冷后移入50mL或100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，将洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。
（2）试样溶液的制备 吸取2.00～5.00mL试样或试剂空白消化液置于50mL或100mL容量瓶内，加1滴或2滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。
（3）标准曲线的绘制 吸取0.00mL、0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL和1.00mL氨氮标准使用溶液（相当于0.00μg、5.00μg、10.0μg、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg和100.0μg氮），分别置于10mL比色管中，加4.0mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀，置于100℃水浴中加热15min，取出用水冷却至室温后，移入1cm比色杯内，以零管为参比，于波长400nm处测量吸光度，根据标准各点吸光度绘制标准曲线或计算线性回归方程。
（4）测定试样 吸取0.50～2.00mL（相当于氮的质量小于100μg）试样和同量的试剂空白溶液，分别置于10mL比色管中，按标准曲线的绘制中自“加4.0mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液”起操作。将试样吸光度与标准曲线比较定量或代入线性回归方程求出蛋白质的含量。
4.结果计算
试样中蛋白质的含量按式（2-3-72）计算。
式中 X——试样中蛋白质的含量（g/100g）；
V1——试样消化液定容体积（mL）；
V2——制备试样溶液的消化液体积（mL）；(www.xing528.com)
V3——试样溶液总体积（mL）；
V4——测定用试样溶液体积（mL）；
m0——试剂空白测定液中氮的质量（μg）；
m1——试样测定液中氮的质量（μg）；
m2——试样质量（g）；
F——氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为5.30。
结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示。当蛋白质含量大于或等于1g/100g时，结果保留三位有效数字；当蛋白质含量小于1g/100g时，结果保留两位有效数字。
5.精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
式中 X——试样中蛋白质的含量（g/100g）；
V1——试样消化液定容体积（mL）；
V2——制备试样溶液的消化液体积（mL）；
V3——试样溶液总体积（mL）；
V4——测定用试样溶液体积（mL）；
m0——试剂空白测定液中氮的质量（μg）；
m1——试样测定液中氮的质量（μg）；
m2——试样质量（g）；
F——氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为5.30。
结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示。当蛋白质含量大于或等于1g/100g时，结果保留三位有效数字；当蛋白质含量小于1g/100g时，结果保留两位有效数字。
5.精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
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