测定酱油中氨基酸态氮的技能训练

1.甲醛值法

（1）原理 利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后定量，以pH计测定终点。

（2）仪器与试剂

1）仪器：pH计、磁力搅拌器、10mL微量滴定管。

2）试剂：甲醛（36%，不含有聚合物）、氢氧化钠标准溶液（0.050mol/L）。

（3）操作步骤 吸取5.0mL试样，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL，置于200mL烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠（0.050mol/L）滴定至pH计指示8.2，记下消耗氢氧化钠标准溶液的体积，可计算总酸含量。

加入10.0mL甲醛溶液，混匀，再用氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH=9.2，记下消耗氢氧化钠标准溶液（0.050mol/L）的体积。

同时取80mL水，先用氢氧化钠标准溶液（0.050mol/L）调节至pH值为8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用氢氧化钠标准溶液（0.050mol/L）滴定至pH=9.2，同时做试剂空白试验。

（4）结果计算 试样中氨基酸态氮的含量按式（2-3-70）进行计算。

式中 X——试样中氨基酸态氮的含量（g/100mL）；

V₁——测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积（mL）；

V₂——试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积（mL）；

V₃——试样稀释液的取用量（mL）；

c——氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L）；

0.014——与1.00mL氢氧化钠标准溶液[c（NaOH）=0.050mol/L]相当的氮的质量（g/mmol）。

计算结果保留两位有效数字。

（5）精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

2.比色法

（1）原理 在pH=4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中，氨基酸态氮与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3，5-二乙酰-2，6二甲基-1，4二氢化吡啶氨基酸衍生物，在波长400nm处测定吸光度，与标准系列溶液比较定量。

（2）仪器与试剂

1）仪器：分光光度计、电热恒温水浴锅（100℃±0.5℃）、10mL具塞玻璃比色管。

2）试剂

①乙酸溶液（1mol/L）：量取5.8mL冰乙酸，加水稀释至100mL。

②乙酸钠溶液（1mol/L）：称取41g无水乙酸钠或68g乙酸钠（CH₃COONa·3H₂O），加水溶解后并稀释至500mL。

③乙酸钠-乙酸缓冲溶液：量取60mL乙酸钠溶液（1mol/L）与40mL乙酸溶液（1mol/L）混合，该溶液的pH值为4.8。

④显色剂：15mL37%甲醇与7.8mL乙酰丙酮混合，加水稀释至100mL，剧烈振摇混匀（室温下放置可稳定三天）。

⑤氨氮标准储备溶液（1.0g/L）：精密称取105℃干燥2h的硫酸铵0.4720g，加水溶解后移入100mL容量瓶中，稀释至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于1.0mg氨基氮（于10℃下的冰箱内储存可稳定一年以上）。

⑥氨氮标准使用溶液（0.1g/L）：用移液管精密称取10mL氨氮标准储备液（1.0mg/mL）置于100mL容量瓶内，加水稀释至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于100μg氨基氮（于10℃下的冰箱内储存可稳定一个月）。

（3）操作步骤

1）精密吸取1.0mL试样置于50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

2）标准曲线的绘制：精密吸取氨氮标准使用溶液0mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL（相当于氨基氮0μg、5.0μg、10.0μg、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg、100.0μg），分别置于10mL比色管中，向各比色管分别加入4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH=4.8）及4mL显色剂，用水稀释至刻度，混匀，置于100℃水浴中加热15min取出，水浴冷却至室温后，移入1cm比色皿内，以零管为参比，于波长400nm处测量吸光度，绘制标准曲线或计算直线回归方程。

3）试样的测定：精密吸取2mL试样稀释溶液（约相当于氨基酸态氮100μg）置于10mL比色管中，按标准曲线的绘制中自“加入4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH=4.8）”起依次操作。将试样吸光度与标准曲线比较定量或代入标准回归方程，计算试样含量。

（4）结果计算 试样中氨基酸态氮的含量按式（2-3-71）进行计算。

式中 X——试样中氨基酸态氮的含量（g/100mL）；

V₁——测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积（mL）；(www.xing528.com)

V₂——试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积（mL）；

V₃——试样稀释液的取用量（mL）；

c——氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L）；

0.014——与1.00mL氢氧化钠标准溶液[c（NaOH）=0.050mol/L]相当的氮的质量（g/mmol）。

计算结果保留两位有效数字。

（5）精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

2.比色法

（1）原理 在pH=4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中，氨基酸态氮与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3，5-二乙酰-2，6二甲基-1，4二氢化吡啶氨基酸衍生物，在波长400nm处测定吸光度，与标准系列溶液比较定量。

（2）仪器与试剂

1）仪器：分光光度计、电热恒温水浴锅（100℃±0.5℃）、10mL具塞玻璃比色管。

2）试剂

①乙酸溶液（1mol/L）：量取5.8mL冰乙酸，加水稀释至100mL。

②乙酸钠溶液（1mol/L）：称取41g无水乙酸钠或68g乙酸钠（CH₃COONa·3H₂O），加水溶解后并稀释至500mL。

③乙酸钠-乙酸缓冲溶液：量取60mL乙酸钠溶液（1mol/L）与40mL乙酸溶液（1mol/L）混合，该溶液的pH值为4.8。

④显色剂：15mL37%甲醇与7.8mL乙酰丙酮混合，加水稀释至100mL，剧烈振摇混匀（室温下放置可稳定三天）。

⑤氨氮标准储备溶液（1.0g/L）：精密称取105℃干燥2h的硫酸铵0.4720g，加水溶解后移入100mL容量瓶中，稀释至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于1.0mg氨基氮（于10℃下的冰箱内储存可稳定一年以上）。

⑥氨氮标准使用溶液（0.1g/L）：用移液管精密称取10mL氨氮标准储备液（1.0mg/mL）置于100mL容量瓶内，加水稀释至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于100μg氨基氮（于10℃下的冰箱内储存可稳定一个月）。

（3）操作步骤

1）精密吸取1.0mL试样置于50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

2）标准曲线的绘制：精密吸取氨氮标准使用溶液0mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL（相当于氨基氮0μg、5.0μg、10.0μg、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg、100.0μg），分别置于10mL比色管中，向各比色管分别加入4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH=4.8）及4mL显色剂，用水稀释至刻度，混匀，置于100℃水浴中加热15min取出，水浴冷却至室温后，移入1cm比色皿内，以零管为参比，于波长400nm处测量吸光度，绘制标准曲线或计算直线回归方程。

3）试样的测定：精密吸取2mL试样稀释溶液（约相当于氨基酸态氮100μg）置于10mL比色管中，按标准曲线的绘制中自“加入4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH=4.8）”起依次操作。将试样吸光度与标准曲线比较定量或代入标准回归方程，计算试样含量。

（4）结果计算 试样中氨基酸态氮的含量按式（2-3-71）进行计算。

式中 X——试样中氨基酸态氮的含量（g/100mL）；

V₁——试样体积（mL）；

V₂——测定用试样溶液的体积（mL）；

50——试样稀释液取用量（mL）；

c——试样测定液中氮的质量（μg）。

（5）精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

式中 X——试样中氨基酸态氮的含量（g/100mL）；

V₁——试样体积（mL）；

V₂——测定用试样溶液的体积（mL）；

50——试样稀释液取用量（mL）；

c——试样测定液中氮的质量（μg）。

（5）精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。