如何测定饼干菌落总数的技能训练

1.原理

饼干是以小麦粉为主要原料，可添加糯米粉、淀粉等，加入（或不加入）糖、油脂及其他原料，经调粉（或调浆）、成形、烘烤等工艺制成的口感酥松或松脆的食品。菌落总数是指食品样品经过处理，在一定条件下培养后所得1mL（g）检样中所含菌落的总数。通过测定菌落总数，可以判定食品被细菌污染的程度，预测食品存用的期限，以便对被检验样品进行卫生学评价时提供依据。

2.指标要求

GB 7099—2003中规定，热加工的糕点菌落总数要求小于或等于1500CFU/g，冷加工的糕点菌落总数要求小于或等于10000CFU/g。饼干属于热加工糕点产品，因此它的菌落总数应小于或等于1500CFU/g。

3.仪器与试剂

（1）仪器 恒温培养箱（36℃±1℃）、冰箱（2～5℃）、恒温水浴箱（46℃±1℃）、天平（感量为0.1g）、均质器、振荡器、1mL无菌吸管（具0.01mL刻度）、10mL无菌吸管（具0.1mL刻度）无菌锥形瓶（容量为500mL）、无菌培养皿（直径为90mm）、无菌试管（ϕ16mm×160mm）、pH计或pH试纸、菌落计数器或放大镜、其他实验室常规灭菌设备（如高温灭菌锅等）。

（2）试剂

1）平板计数琼脂培养基：将胰蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、琼脂15.0g加入1000mL蒸馏水，煮沸溶解，调节pH值至7.0，分装在锥形瓶中，于121℃高压灭菌15min。

2）磷酸盐缓冲液：称取34.0g磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.2，用蒸馏水稀释至1000mL后储存于冰箱中。用时，取储存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，于121℃高压灭菌15min。

3）0.85%灭菌生理盐水。称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，于121℃高压灭菌15min。

4.操作步骤

（1）检验流程 菌落总数检验流程如图2-3-5所示。

图2-3-5 菌落总数检验流程

（2）样品的稀释 称取25g研细的饼干样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，以8000～10000r/min的转速均质1～2min，制成1∶10的样品匀液。用1mL无菌吸管吸取上述样品匀液1mL，沿管壁缓慢注入盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸管头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。依次操作，制备10倍系列稀释样品匀液，如图2-3-6所示。

图2-3-6 样液稀释及倾注过程示意图

（3）倾注平皿 根据对样品污染状况的估计，选择2个或3个适宜稀释度的样品匀液，吸取1mL置于无菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。及时将15～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

（4）培养 待琼脂凝固后，将平板翻转，于36℃±1℃培养48±2h。

（5）平板菌落的选择 选取菌落数为30～300CFU的平板作为菌落总数测定标准。不宜采用较大片状菌落生长。一个稀释度使用两个平板，应取平均数。

（6）菌落计数 可用肉眼观察，必要时放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。(www.xing528.com)

5.菌落总数的计算

1）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，则计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克样品中菌落总数结果。

2）若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，则按式（2-3-17）计算。

式中 N——样品中菌落数；

ΣC——平板（含适宜范围菌落的平板）菌落数之和；

n₁——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n₂——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

3）若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

4）若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

5）若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

6）若所有稀释度的平板菌落数均不为30～300CFU，其中一部分小于30CFU或大于300CFU，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

6.菌落总数的报告

1）菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”的原则修约，以整数报告。

2）菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”的原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”的原则修约后，采用两位有效数字。

3）若所有平板上均为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

4）若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

7.注意事项

在样品稀释过程中，每递增稀释一次，换用1次无菌吸管。称重取样以CFU/g为单位报告。