如何测定大肠菌群MPN计数法？

1.检验程序

大肠菌群MPN计数法检验程序如图2-2-2所示。

2.样品的稀释

1）固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，以8000～10000r/min的转速均质1～2min；或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。

2）液体样品：用无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。样品匀液的pH值应为6.5～7.5，必要时分别用1mol/L的NaOH溶液或1mol/L的HCl溶液调节。

图2-2-2 大肠菌群MPN计数法检验程序

3）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入盛有9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。(www.xing528.com)

4）根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程的时间不得超过15min。

3.初发酵试验

每个样品选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（若接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），于36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生。对24h±2h内产气者进行复发酵试验；若未产气，则继续培养至48h±2h，对于产气者进行复发酵试验，而未产气者为大肠菌群阴性。

4.复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，于36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况，将产气者计为大肠菌群阳性管。

5.大肠菌群最可能数（MPN）的报告

按确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每克（毫升）样品中大肠菌群的MPN值。