微生物检验器皿消毒灭菌的方法大揭秘！

微生物检验无菌技术的基础是要求检验所用的培养基、器皿、用具等都必须是无菌的。借助于不同的消毒和灭菌技术手段，可不同程度地减少或完全杀灭环境中的微生物。消毒灭菌技术也是微生物最基本的试验技术之一，是微生物检验工作的基础。

1.常用概念

（1）灭菌 灭菌是采用强烈的理化因素杀死物体表面及内部的所有微生物（包括病原微生物和非病原微生物）繁殖体及芽孢的过程。灭菌后的物体不再有任何可存活的微生物营养体及其芽孢、孢子，即处于无菌状态，否则就是灭菌不彻底。

（2）消毒 消毒是用较为温和的理化因素仅杀死物体表面或内部一部分对人或动、植物有害的病原微生物，而对被消毒的对象基本无害的措施。具有消毒作用的药物称为消毒剂。一般消毒剂在常用浓度下只对细菌的营养体有效，对细菌的芽孢则无杀灭作用。

（3）无菌 无菌是指不含活的微生物。只有通过彻底灭菌，才能达到无菌要求。灭菌是无菌的先决条件，无菌是灭菌的后果。食品微生物检验操作必须在无菌环境中用无菌操作进行。

（4）防腐 防腐是利用理化因素完全抑制微生物的生长繁殖，防止食品、生物制品等霉变腐败的措施。用于防腐的药剂称为防腐剂。某些药物在低浓度时是防腐剂，在高浓度时是消毒剂。低温、干燥、无氧、高渗透压等都是常用的防腐措施。

（5）商业无菌 经过适度的杀菌后，不含有致病性微生物，也不含有在通常温度下能繁殖的非致病性微生物的状态叫做商业无菌。

2.常用的消毒与灭菌方法

消毒与灭菌的方法很多，可分为物理法和化学法两大类。物理法包括加热灭菌（干热灭菌和湿热灭菌）、过滤除菌、紫外线辐射灭菌等。化学法主要是利用无机或有机化学药剂对试验用具和其他物体表面进行消毒与灭菌。人们可根据微生物的特点、待灭菌材料与试验目的和要求来选用具体方法。一般来说，玻璃器皿可用干热灭菌法，培养基用高压蒸汽灭菌法，某些不耐高温的培养基（如血清、牛乳等）可用巴斯德消毒法、间歇式灭菌法或过滤除菌法，无菌室和无菌罩等可用紫外线辐射、化学药剂喷雾或熏蒸等方法灭菌。

（1）加热灭菌 利用加热方法进行灭菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高温可使微生物细胞内的蛋白质和酶类变性而失去活力，从而起到灭菌作用。

加热灭菌法包括干热灭菌和湿热灭菌两种。在同一温度下，湿热灭菌的杀菌效力比干热灭菌大，穿透能力强。另外，湿热灭菌时的蒸汽有潜热存在，能迅速提高被灭菌物品的温度。

1）干热灭菌法：通过使用干热空气杀灭微生物及其芽孢的说法叫干热灭菌法。干热灭菌包括烘箱热空气灭菌和火焰灼烧灭菌两种方法。

①烘箱热空气灭菌：将耐热待灭菌物品放于鼓风干燥箱内，利用热空气进行灭菌的方法。由于空气的传热性和穿透力不及饱和蒸汽，再加上菌体在脱水情况下不易被热能杀死，所以烘箱热空气灭菌需要较高的温度和较长的时间，一般于160℃加热2h。灭菌时间可根据被灭菌物品体积进行适当调整。此方法适用于对体积较大的玻璃、金属器皿和其他耐干燥物品进行灭菌，如培养皿、锥形瓶、吸管、烧杯、金属用具等。这种方法的优点是能使灭菌物品保持干燥。

采用烘箱热空气灭菌法时要注意：玻璃器皿要先洗净、干燥，然后用纸巾正确包裹和加塞，而后才能放入烘箱中灭菌，以保证玻璃器皿灭菌后不被外界杂菌污染；金属器皿要放入带盖磁盘或其他耐热容器内进行灭菌；升温或降温不能过急；箱温不要超过180℃，以免引起包装纸自燃；箱内温度降到60℃以下时才能开箱取物；灭菌后的物品应随用随打开包装纸。

玻璃器皿的包装方法为：培养皿常用报纸包装，一般以5～10套为宜，或者装在金属平皿筒内；对于试管和锥形瓶，应在试管管口和锥形瓶瓶口内塞好棉花塞或硅胶泡沫塑料塞，再包以厚纸，用棉绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外部杂菌污染；对于封口的试管，可按试验需要将数个扎成捆进行干热或湿热灭菌；对于吸管，应在其顶端塞一小段棉花，以免使用时将杂菌吹入吸管中或将微生物吸出吸管外，将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的近右端，与纸条约成45°角，并利用余下的一段纸条将吸管卷好（见图2_-1-2），按此方法包好的吸管可单独灭菌，也可集中用报纸扎成捆后进行干热或湿热灭菌。

图2-1-2 吸管的包扎流程

②火焰灼烧灭菌：将待灭菌物品在酒精灯火焰上灼烧以杀死其中的微生物的灭菌方法。这是一种最简便、快捷的干热灭菌方法，但只适用于体积较小的金属器皿或玻璃仪器，如接种环、接种针、试管口或玻璃棒的灭菌。(www.xing528.com)

2）湿热灭菌法：一种用煮沸或饱和热蒸汽杀死微生物的方法。与干热灭菌法相比，其灭菌温度较低，灭菌时间短。湿热灭菌的范围比干热灭菌广。湿热灭菌法有高压蒸汽灭菌法、间歇灭菌法和巴斯德消毒法。

①高压蒸汽灭菌法。利用高压蒸汽灭菌锅内温度高于100℃的蒸汽杀灭微生物的方法称为高压蒸汽灭菌法。其原理是水的沸点随着蒸汽压力的增加而升高，加大压力是为了提高水的沸点。在密闭系统中，蒸汽压力增高，温度也随着增高，从而提高杀菌效力。

高压蒸汽灭菌所使用的灭菌压力和时间因被灭菌的物品的不同而有差异。一般灭菌时，采用104kPa的压力（温度为121.3℃），灭菌时间为20～30min；一些耐高温、容积大的物品，压力一般为154kPa，温度为128℃，时间延长到1～2h；在高温下易破坏的物质，可采用67kPa、68kPa的压力，温度为115℃，灭菌时间为35min左右。灭菌时间从达到要求的温度或压力时开始算起。

影响高压蒸汽灭菌效果的主要因素有：

a.灭菌物体的含菌量。

b.灭菌锅内空气的排除程度。利用高压蒸汽灭菌时，必须彻底排除灭菌锅内的残余空气。

c.灭菌对象的pH值。pH值为6.0～8.0时，微生物较不易死亡；pH＜6.0时，最易引起微生物死亡。

d.灭菌对象的体积。在实验室内对培养基进行灭菌时，要防止用常规的压力和时间对锅内大容量培养基进行灭菌。

e.加热与散热速度。在高压蒸汽灭菌时，预热、散热的速度对灭菌效果和培养基成分都会产生影响。

②间歇灭菌法。利用常压蒸汽反复多次进行灭菌的方法称为间歇灭菌法。该方法主要适用于一些不宜高压灭菌的培养基的灭菌，如糖类、明胶、牛奶等。此方法是在常压下加热到100℃，维持30～60min，以杀死微生物营养体，冷却后，于适宜温度（37℃）下培养1天，次日再用相同的方法灭菌，如此反复3次，即可达到灭菌目的。适温培养的目的是诱导未死亡的芽孢萌发成耐热性差的营养体，便于在下次灭菌时将其杀灭。其缺点是手续麻烦，时间长。

③巴斯德消毒法。该方法适用于在高热下易被破坏营养成分的食品，如牛奶、啤酒、果酒和酱油等。该方法把液体物质在较低的温度下消毒，既可杀死液体中致病菌的营养体，又不破坏液体物质中原有的营养成分。典型的温度时间组合有两种：63℃，30min；72℃，15s。巴斯德消毒法在食品工业上常被采用。

（2）煮沸消毒法 直接将要消毒的物品放入清水中，煮沸15min，即可杀死细菌的全部营养体和部分芽孢。若在清水中加入碳酸钠或苯酚，则效果更好。此方法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。

（3）紫外线杀菌法 紫外线是一种短波光，大剂量为杀菌剂，小剂量为诱变剂。它的杀菌原理主要是：紫外线引起核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰核酸的复制。此外，紫外线还可使空气中的氧变为臭氧，而臭氧不稳定，易分解，放出氧化能力强的新生态氧[O]，具有杀菌作用。紫外线的杀菌效果与波长有关，波长约为260nm的紫外线杀菌能力最强。

紫外线是接种室、培养室和手术室进行空气灭菌的常用工具。市售紫外灯有30W、20W和15W等多种规格。灭菌时常选用30W紫外灯，菌种诱变时多时选用15W紫外灯。紫外灯的有效作用距离为1.5～2.0m，以1m内效果为最好。使用前应做好被照射区域的卫生，照射30min即可。紫外灯的杀菌效果会随着照射时间的延长而降低，应适时更换。紫外灯照射不久，空气中就会产生臭氧，可根据臭氧产生的速度和强弱，粗略判断灯管的质量。有些经照射受损害的菌体若再暴露于可见光中，则会发生光复活。为了避免光复活现象出现，应在黑暗中保持30min。紫外线对真菌作用的效果较差，使用时应配合其他消毒灭菌方法。

紫外线的穿透力很弱，一薄层玻璃或水都能将其大部分过滤掉，因此紫外线只能用作物体表面消毒或空气灭菌，如对灭菌室的灭菌和对一些不能用热或化学物质灭菌的器械的灭菌。紫外线对人的皮肤、眼黏膜及视神经有损伤作用，因此应避免直视紫外灯灯管和在紫外线照射下工作。

（4）过滤除菌法 过滤除菌法是指将含菌的液体或气体通过一个称为细菌滤器的装置，使杂菌受到机械的阻力而留在滤器或滤板上，从而达到去除杂菌的目的。凡不能耐受高温或化学药物灭菌的药液、毒素、血液等，可采用过滤除菌法灭菌。