工作任务
了解食品微生物快速检测方法，请思考：
在目前我国食品微生物检测项目中，还有哪些项目有待开发快速检测项目。
知识准备
【案例导入】
黑龙江2038个食品安全快速检测箱为食品安全把关
黑龙江启动工商系统食品安全快速检测箱以防假冒伪劣食品和违规食品添加剂流入市场，确保百姓吃上放心食品。
该食品安全快速检测箱分为两种，分别可检测21个项目和19个项目，可以检测出食用农产品的农药兽药残留、甲醛含量、水分含量等，也可以对散装食品、现场加工制作食品的配料成分、微生物含量及是否含有禁用工业化学品等进行快速检测。
微生物检测系统效力2008年奥运食品安全
为圆满完成2008年奥运会食品检测任务，北京微量化学研究所分析中心购买了“HR型高分辨率全自动菌落分析仪”，以应对奥运史上史无前例的检测力度和复杂多样的样品。
HR型高分辨率全自动菌落分析仪将食品微生物经典培养检测法的菌落计数和数据分析自动化，使检测结果更可靠。全自动的设计可以节省人工和运营成本，使食品检测在奥运会繁重的检测任务中更为高效迅速。
【问题引导】
1.为什么要进行微生物的快速检测？
2.你还知道哪些快速的微生物检测方法？
一、微生物检测现状
目前我国各地的食品化验室及卫生防疫机构所应用的常规微生物检验方法如标准平皿菌计数法、大肠菌群乳糖胆盐发酵法和某些病原菌的检验方法等，主要包括形态结构、细胞培养、生化试验、血清学分型、噬菌体分型、毒性试验及血清凝聚等。这些方法存在操作繁琐、费时、手工操作、卫生指导反应慢的缺点，给食品生产和流通带来一定的影响。随着消费者对食品安全的要求提高，对微生物检验方法提出了更高的要求，要求快速、方便检测。
为适应社会发展的需要，食品微生物检验逐渐向自动化检验和快速检验的方向发展，其趋势是灵敏度高、特异性强、重复性大、快速、简便和经济等。近年来，随着分子生物学和电子技术的发展，快速、准确、特异检验微生物的新技术、新方法不断涌现，微生物检验技术由培养水平向分子水平迈进，并向仪器化、自动化、标准化方向发展，提高了食品微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性。
二、皿膜系统法
皿膜系统法可用于菌落总数、大肠菌群、大肠埃希氏菌、霉菌、酵母和金黄色葡萄球菌等的检测。
1.原理
皿膜系统由双层膜构成（见图7-1）。在双层膜系统内含有干燥的营养物质（类似平板计数琼脂培养基或其他的选择性培养基成分）和冷水可溶的胶体物质，以每系统1mL的加样量将样品（稀释或未经稀释的样品）直接加到基础膜中间，盖上含有胶凝剂和TTC的覆盖膜，培养后细菌在双层膜之间生长并显色即可直接计数。
图7-1 皿膜系统结构图
2.仪器和试剂
3.储藏与使用方法
（1）未开封时，产品冷藏于≤8℃，并在保存期内用完，高湿度时，凝固水可以排除，包装物最好于室温启开。
（2）已开封的袋，将封口以胶带封紧。
（3）已启开的包装袋不要冷藏，并于一个月内使用完。
（4）制备食物样品稀释液，称取或吸取食物样品，置入适宜的无菌容器内，如均质袋、稀释瓶或者其他容器内。
（5）加入适量的无菌稀释液稀释。
（6）搅拌或均质样品。
（7）将测试片置于平坦表面处，揭开上层膜。
（8）使用吸管将1mL样液垂直滴加在测试片的中央处。
（9）小心将上层膜缓慢盖下，避免有气泡产生，切勿使上层膜直接落下。
（10）使用压板（平面底朝下）放置在上层膜中央处。
（11）轻轻压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上，切勿扭转压板。
（12）拿起压板，静置至少1min，以使培养基凝固。
（13）测试片的透明面朝上，可堆叠至20片。
（14）可目视及用标准菌落计数器或其他的照明放大镜计数，并可参考判读卡进行菌落计数。
（15）可以分离菌落作进一步鉴定，即掀起上层膜，由培养胶上挑取单个菌落。
4.结果判定
下面以3M微生物快速测定结果为例，了解皿膜系统测试片的测试结果，如图7-2所示。
三、ATP生物发光技术
ATP生物发光技术是利用产生于生物体内的化学发光现象而建立起来的检测方法。
1.原理
所有的生物都含有ATP，当荧光素酶系统和ATP接触时就会发光。荧光素酶系统以荧光素（1uciferin）、ATP和O2为底物，在Mg2+存在时将化学能转变成光能的高效生物催化剂，催化D-荧光素（D-1uciferin）氧化脱羧，同时发出光，最大发射波长为562nm，但酶结构不同，则发射光略有不同。
图7-2 3M微生物快速测定结果
测定时先将样品与ATP提取试剂混合，使细胞膜和细胞壁开孔，提取出ATP，然后再与荧光素和荧光素酶生物发光试剂作用，用荧光仪进行测定。
因为每种微生物细胞中的ATP含量是恒定的，所以样品中ATP含量与样品中微生物的数量有关。ATP荧光仪最快能在15s内测定食品中是否存在酵母菌、霉菌或细菌细胞，且灵敏度可达1个微生物/200mL（Anon1987）。
2.检测仪器和试剂
用于微生物ATP测定的仪器较多，如ATP测定仪AF-100（图7-3），Charm LUM-T和生物光测定仪Biometer、Lab-LineATP光度计等。试剂为ATP提取液，生物荧光试剂。
图7-3 微生物ATP测定仪
四、应用LAMP技术快速测定致病菌
1.LAMP技术工作原理
环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是近年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对待测菌靶向基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件（63℃左右）保温30～60min，即可完成核酸扩增反应。
与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。
2.LAMP检测的优势
（1）特异性高 4条引物靶向目标基因6个区段，根据是否扩增即可判断靶基因的存在与否。
（2）灵敏度高 Loop环介导链延伸，检测下限达10CFU/mL。
（3）检测时间短 恒温扩增，省却温度循环，不需电泳检测，且扩增效率高，全过程仅需60min。
（4）仪器要求宽松 不需要PCR仪和检测仪器，仅使用水浴锅就能完成反应。
（5）操作简单 比传统PCR简单，操作人员无需额外培训，反应后不需电泳检测。(www.xing528.com)
（6）结果判读简单 根据颜色改变判读结果，无需电泳检测。
3.操作流程
（1）加入预处理的样品；
（2）放入65℃恒温水浴中保温60min；
（3）根据反应液颜色直接判读结果。
4.实验方法
应用LAMP试剂盒检测金黄色葡萄球菌方法如下。
（1）样品采集及存放 本试剂盒适用于增菌液或可疑菌落样本。样品制备、增菌培养和分离按照GB4789.10—2016标准方法进行。待测样品在2～8℃保存不应超过24h；-20℃可长期保存，应避免反复冻融。
（2）样品处理 增菌液模板DNA的制备，对于标准方法培养的增菌液：
①直接取该增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量弃去上清；
②加入80μLDNA提取液，混匀后沸水浴20min，置于冰上10min；
③10000r/min离心2min，上清即为核酸模板；取上清置于-20℃可长期保存备用。
可疑菌落模板DNA的制备：对于标准方法分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，加入80μL样品预处理液，再按照上述步骤③制备模板DNA，以待检测。
（3）核酸扩增
①试剂盒内反应液Sau使用前建议室温熔化振荡混匀后，2000r/min离心10s；其余室温熔化后，2000r/min离心10s即可。
②设所需LAMP反应管数为n（n=样品数+1管阳性对照+1管阴性对照），每个PCR反应管中体系如表7-1所示：
表7-1 PCR反应管的体系表
③计算好各试剂的用量，加入一洁净的1.5mL离心管中，混合均匀， 2000r/min离心10s，向设定的n个PCR反应管中分别加入22.5μL上述混合液，在上述每个反应管中再分别加入30μL稳定液。移至样品处理区加样；
④向上述n个PCR反应管内按顺序分别加入阴性对照、待检模板和阳性对照各2.5μL，盖紧管盖并做好标记，移至反应区；
⑤置65℃恒温反应60min。
（4）结果检测 取出PCR反应管，冷却至室温，2000r/min离心10s，分别加入2μL显色液，轻轻混匀，即可观察；建议在黑色背景下观察。
（5）结果判断 在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：
①待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为金黄色葡萄球菌阳性；
②待检样品反应管液体呈橙色，则可报告金黄色葡萄球菌检验结果为阴性；
若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。
（6）注意事项 严格执行行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管理规范。LAMP试剂盒仅用于体外检测，使用前请仔细阅读试剂盒说明书全文。实验要严格分区操作，各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染：
第一区：试剂准备区——准备所需试剂
第二区：标本制备区——待测样品及对照样品处理
第三区：反应和分析区——扩增及结果分析
①反应温度应在60～65℃范围内，请确保仪器的真实温度。建议使用经校正的仪器。
②试剂盒内各试剂使用前，充分熔化后稍离心；避免反复冻熔。
③在-20℃保存的样品DNA提取产物，应在加样前置室温熔化，作短暂离心后使用。
④实验过程中请穿工作服，戴一次性手套，建议使用带滤芯的一次性吸嘴。
⑤加样、分装时应尽量避免产生气泡，反应前注意检查各反应管是否盖紧，以免因泄漏而污染仪器。
⑥结果观察时应小心谨慎，避免振荡过于剧烈致反应产物外逸，建议在通风橱或生物安全柜中操作。
⑦反应管冷却至室温后观察结果，可有效避免反应产物外逸，建议取出后置室温冷却。
⑧试剂盒内的阳性对照应视为具有污染性物质，应注意避免污染其他样品和反应试剂，导致错误的检验结果。
⑨分析完毕后，反应管密封在专用的容器内，丢弃于指定地点；实验过程中的废弃物和一次性耗材须经灭菌后丢弃。
⑩工作台及各物品定期用1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯处理。
五、紫外荧光过滤膜法
紫外荧光技术是测定乳、肉、禽和禽制品、鱼和鱼制品、水果和蔬菜、啤酒和葡萄酒、辐射食品等食品及水中的微生物的快速方法。
1.原理
利用紫外光显微镜来快速测定活菌数。首先用一特殊滤膜过滤样品，经吖啶橙染色后，用紫外光显微镜观察，活细胞呈橙色荧光，死细胞呈绿色荧光。
2.仪器和试剂
过滤装置、落射光荧光显微镜、36%的甲醛、0.1%的吖啶橙溶液、0.2μm的聚碳酸酯滤膜。
3.操作方法
取10mL液体样品于试管中，加入0.5mL36%的甲醛固定样品，将2mL 0.1%的吖啶橙溶液加入样品中，染色3min，然后将细菌过滤到事先用Irgalan黑染色的聚碳酸酯滤膜上，滴上一滴无自发荧光的香柏油，盖上盖玻片，置于落射光荧光显微镜的油镜下，计数10个视野中的细菌数，经测量视野面积及滤膜有效面积而换算出样品中所含细菌数量。
吖啶橙染色计数法在国外已逐步作为细菌计数的一种标准方法，应用于水、食品等领域。
六、阻抗法
阻抗法是用电阻抗作为媒介，测定因微生物生长而产生的阻抗改变，从而对微生物数量进行快速估测。
阻抗法近年来已逐步用于食品检测之中，如法国的Bactometer系统已可用于乳制品、肉类、海产品、蔬菜、冷冻食品、糖果、糕点、饮料、化妆品中的总菌数、大肠菌群、霉菌和酵母计数、乳酸菌、嗜热菌测试，比传统方法减少了检验时间，结果准确。
1.Bactometer系统的原理
当细菌生长时，周围液体的电导发生变化，通过测定阻抗或电导，可以了解微生物的活动。Bactometer系统是利用阻抗变化来检测微生物。系统测定细菌的阈值为106～107个/mL，酵母阈值为102～104个/mL。Bactometer系统可同时处理64～512个样本。
2.仪器设备及试剂
Bactometer系统由BPU电子分析器/培养箱、电脑、彩色终端机及打印机组成，专用培养基，一次性反应检测盒，加样器。
3.Bactometer系统的操作方法
开机后打开BPU选择试验类型，检测样品的标准曲线须预先制定，将培养基加入检测盒的检测池内，每一池加0.5～1.0mL，将选择好所需要稀释度的样品每一池加0.1mL，将检测盒插入培养箱内的电极板上培养，检测结束后仪器将自动分析检测结果。
阻抗法的主要优点是可以进行数据自动测试、自动分析储存，但必须预先制定相应的标准曲线方可对样品进行测试。
工作任务实施
请同学们查找相关资料，自行发现在目前我国食品微生物检测项目中，还有哪些项目有待开发快速检测项目。
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