【案例导入】
乳酸菌饮料中活菌量成疑
某超市内，乳品饮料区的促销活动如火如荼地进行，活性乳酸菌饮料俨然成为了明星产品。记者观察到这些活性乳酸菌饮料有很多共同点，它们大都宣称“0脂肪”，有减肥、美容、排毒等功效，且价格都较高，340～450mL在6～8元之间；其次就是标榜含有大量活性乳酸菌，有的外包装上标注每百毫升中含有300亿活性乳酸菌。
【问题引导】
合格的发酵乳产品应该含有多少乳酸菌？
一、乳酸菌
乳酸菌（lactic acid bacteria）是一群能利用可发酵性碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。乳酸菌的种类较多，目前已发现有23个属。在发酵乳制品中涉及有乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、明串珠菌属和双歧杆菌属。最常用的是干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌、丁二酮链球菌、乳脂链球菌、噬柠檬酸链球菌、双歧杆菌等。
1.保加利亚乳杆菌
细胞两端钝圆，呈细杆状，单个或成链，频繁传代易变形。属革兰氏阳性微厌氧菌，最适培养温度为40～43℃，能发酵葡萄糖、果糖和乳糖，但不能利用蔗糖。对热耐受性差，个别菌株75℃时能耐20min。蛋白分解力弱。对抗生素不如嗜热链球菌敏感。培养基和培养温度对细胞形态影响很大，在20℃乳中培养，细胞可成为长的纤维状菌；50℃下培养，细胞停止生长，如在此温度下继续培养，其细胞形状变得不规则；在冷的酸奶中，由于温度和高酸度的影响，会有异常杆菌出现；可能是由于氧的阻碍作用或者因为氮源不适当，在琼脂平板上培养时，细胞形状不规则。属同型发酵乳酸菌，产生D（-） -乳酸，能产生香味物质乙醛。
2.嗜热链球菌
细胞呈卵圆形，成对或形成长链。属革兰氏阳性微需氧菌，最适培养温度为40～45℃，能发酵葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖。在85℃条件下，能耐20～30min。蛋白分解力微弱。对抗生素极敏感。细胞形态与培养条件有关，在30℃乳中培养时，细胞成对，而在45℃时呈短链；在高酸度乳中形成长链；液体培养时，细胞呈链状，平板培养时细胞膨胀变粗，有时会成杆菌状，形成针尖状菌落；该菌的某些菌株在平板移接时，若中间不经过牛乳培养而直接将细胞涂平板时往往得不到菌落，这些菌株是典型的牛乳菌。属同型发酵乳酸菌，产生L（+） -乳酸。能产生香味物质双乙酰。
3.双歧杆菌
双歧杆菌属革兰氏阳性专性厌氧菌，但目前用于生产活菌制剂的一些菌株是耐氧菌株。经多次传代培养，G染色反应转呈阴性。最适培养温度为37℃左右。能发酵葡萄糖、果糖、乳糖和半乳糖。除两歧双歧杆菌仅缓慢利用蔗糖外，短双歧杆菌、长双歧杆菌和婴儿双歧杆菌等均能发酵蔗糖。对热耐受性差，蛋白分解微弱，对抗生素敏感。细胞形状多样，同一菌种，不同培养条件，细胞的形态很不一样，有棍棒状、勺状、V字形、弯曲状、球杆菌状和Y字形等。属异型发酵乳酸菌。
二、乳酸菌的检验方法
食品中乳酸菌的检验方法严格依照GB4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 乳酸菌检验》进行，该标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌的检验方法，适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。该标准中所检验的乳酸菌主要为乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属。
1.仪器和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱（36℃±1℃），冰箱（2～5℃），均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵，天平（感量0.1g），无菌试管（18mm×180mm、15mm×100mm），无菌吸管（1mL，具0.01mL刻度；10mL，具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头，无菌锥形瓶（500mL、250mL）。
2.培养基及试剂
生理盐水，MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基及莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）和半胱氨酸盐酸盐（Cysteine Hydrochloride）改良MRS培养基，MC培养基（Modified Chalmers）培养基，0.5%蔗糖发酵管，0.5%纤维二糖发酵管，0.5%麦芽糖发酵管，0.5%甘露醇发酵管，0.5%水杨苷发酵管，0.5%山梨醇发酵管，0.5%乳糖发酵管，七叶苷发酵管，革兰氏染色液，莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin），半胱氨酸盐酸盐（CysteineHydrochloride）。
3.检验程序
乳酸菌检验程序如图6-2所示。
图6-2 乳酸菌检验流程图
（1）样品制备 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
①冷冻样品可先使其在2～5℃条件下解冻，时间不超过18h，也可在温度不超过45℃的条件解冻，时间不超过15min。
②固体和半固体食品：以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000～10000r/min均质1～2min，制成1∶10样品匀液；或置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min制成1∶10的样品匀液。
③液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1∶10的样品匀液。
（2）步骤
①用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。
②另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。
③乳酸菌计数。
A.乳酸菌总数。
乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明见表6-1。
表6-1 乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明
B.双歧杆菌计数。
根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48℃的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良的MRS培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。36℃±1℃厌氧培养72h±2h，培养后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。
C.嗜热链球菌计数。
根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48℃的MC培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。36℃±1℃需氧培养72h±2h，培养后计数。嗜热链球菌在MC琼脂平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径2mm±1mm，菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。
D.乳杆菌计数。
根据待检样品活菌总数的估计，选择2～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48℃的MRS琼脂培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。36℃±1℃厌氧培养72h±2h。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。
（3）菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units， CFU）表示。
①选取菌落数在30～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
②其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
③当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
（4）结果的表述
①若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（毫升）中菌落总数结果。
②若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下列公式计算：
式中 N——样品中菌落数；
∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；(www.xing528.com)
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
③若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
④若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
⑤若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
⑥若所有稀释度的平板菌落数均不在30～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
（5）菌落数的报告
①菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
②菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
③称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。
4.结果与报告
根据菌落计数结果出具报告，报告单位以CFU/g（mL）表示。
5.乳酸菌的鉴定（可选做）
（1）纯培养 挑取3个或以上单个菌落，嗜热链球菌接种于MC琼脂平板，乳杆菌属接种于MRS琼脂平板，置36℃±1℃厌氧培养48h。
（2）鉴定
①双歧杆菌的鉴定按GB4789.34—2016的规定操作。
②涂片镜检：
乳杆菌属菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性。
嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为0.5～2.0μm，成对或成链排列，无芽孢，革兰氏染色阳性。
③乳酸菌菌种主要生化反应见表6-2和表6-3。
表6-2 常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应
注：+表示90%以上菌株阳性：-表示90%以上菌株阴性；d表示11%～89%菌株阳性；ND表示未测定。
表6-3 嗜热链球菌的主要生化反应
注：+表示90%以上菌株阳性；-表示90%以上菌株阴性。
工作任务实施
（一）原料乳中抗生素的检测
1.小组讨论，制定检测工作方案，确定人员分工，并填写以下工作文件
2.完成实验准备工作
（1）药品和试剂的准备
（2）实验设备的准备
（3）实验用具的准备
3.检测过程
严格规范检测操作，保证结果的可靠性。
4.结果分析及检测报告的撰写
5.实验后整理
（二）酸乳中乳酸菌的检测
1.小组讨论，制定检测工作方案，确定人员分工，并填写以下工作文件
2.完成实验准备工作
（1）药品和试剂的准备
（2）实验设备的准备
（3）实验用具的准备
3.检测过程
严格规范检测操作，保证结果的可靠性。
4.结果分析及检测报告的撰写
5.实验后整理
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