李斯特菌检验：关注项目三单核细胞增生

知识准备

【案例导入】

2011年9月12—27日，美国疾病预防控制中心（CDC）网站上陆续报道了一起单增李斯特菌引起的食源性疾病暴发事件。从2011年7月31日出现首例报告病例至9月26日上午11点（美国东部时间），共报告病例72例，死亡13例，这是10多年来美国最严重的一起食源性疾病暴发事件。此次暴发涉及美国18个州，美国有关州、地区和联邦公共卫生管理部门启动联合调查，通过流行病学、溯源和实验室调查后发现这起暴发与食用来自科罗拉多州的格兰纳达波尼地区（Granada）的Jensen农场种植的香瓜（cantaloupe）相关。

【问题引导】

1.什么是单核细胞增生李斯特菌？

2.单核细胞增生李斯特菌都有哪些危害？

一、单核细胞增生李斯特菌

李斯特菌（Listeria monocytogenes）又名单核球增多性李斯特菌、李氏菌。李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。目前国际上公认的李斯特菌共有七个菌株：

单核细胞增生李斯特菌（L.monocytohenes）

绵羊李斯特菌（L.iuanuii）

英诺克李斯特菌（L.innocua）

威尔斯李斯特菌（L.innocua）

西尔李斯特菌（L.seeligeri）

格氏李斯特菌（L.grayi）

默氏李斯特菌（L.murrayi）

其中单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌，它主要以食物为传染媒介，是最致命的食源性病原体之一。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。

1.生物学特性

（1）形态与染色 单增李斯特菌为球杆状，大小约为0.5μm×（1.0～2.0）μm，直或稍弯，两端钝圆，常成双排列，革兰氏阳性，有鞭毛，无芽孢，可产生荚膜。一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。根据菌体鞭毛抗原，分为四个血清型和若干亚型。

（2）培养特性 该菌营养要求不高，在20～25℃培养有动力，但在37℃时动力缓慢，此特征可作为该菌初步判定。穿刺培养2～5d可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。该菌在5～45℃均可生长，在5℃低温生长是典型特征之一，经58～59℃10min可杀死，在-20℃可存活一年，耐碱不耐酸，在pH9.6中仍能生长，在6.5% NaCl肉汤中生长良好，在10%NaCl中可生长，在4℃的20% NaCl中可存活8周。

在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。在5%～7%的血平板上，菌落通常也不白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂（TSAYE）和改良McBride（MMA）琼脂上，用45°角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈蓝色、灰色或蓝灰色。

（3）生化反应 该菌触酶阳性，氧化酶阴性，能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖，不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。

（4）抵抗力 该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活，对碱和盐抵抗力强，60～70℃经5～20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌。该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。

2.分布和传播

单增李斯特菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6%～16%，有70%的人可短期带菌，4%～8%的水产品、5%～10%的乳及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软乳酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛乳、巴氏消毒乳、冰淇淋、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、番茄、法式馅饼、冻猪舌等而感染，占85%～90%的病例是由被污染的食品引起的。

3.危害

单增李斯特菌进入人体后是否发病，与菌的毒力和宿主的年龄、免疫状态有关，因为该菌是一种细胞内寄生菌，宿主对它的清除主要靠细胞免疫功能。因此，易感者为新生儿、孕妇及40岁以上的成人，此外，酗酒者、免疫系统损伤或缺陷者、接受免疫抑制剂和皮质激素治疗的患者及器官移植者也易被该菌感染。

该病的临床表现为，健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。

单增李氏菌的抗原结构与毒力无关，它的致病性与毒力机理如下：

（1）寄生物介导的细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞；

（2）抗活化的巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的过氧物（为杀菌的毒性游离基团）分解；

（3）溶血素，即李氏杆菌素O，可以从培养物上清液中获得，为SH活化的细胞溶素，有α和β两种，为毒力因子。

4.控制

单增斯特菌主要通过食物感染人类，可以寄居在人的肠道内。它有个外号叫“冰箱杀手”，因为它在0～45℃都能生存，尤其在冰箱的冷藏温度下仍可以生长繁殖，甚至在-20℃的冷冻室也能存活1年，这是绝大多数微生物做不到的。调查显示，被李斯特菌感染的人，有64%可以在他家里的冰箱中找到这种细菌。所以未加热的冰箱食品增加了食物中毒的危险。冰箱食品需加热后再食用。

不仅如此，李斯特菌还具有耐干燥、耐高盐环境的能力，且在一般热加工处理中能存活，可以说它的生命力比较顽强，因此在食品加工中，中心温度必须达到70℃持续2min以上才能起到杀灭作用。

单增李斯特菌在自然界中广泛存在，所以即使产品已经过热加工处理充分灭活了单增李斯特菌，但有可能造成产品的二次污染，因此蒸煮后防止二次污染是极为重要的。由于单增李斯特菌在4℃下仍然能生长繁殖。

二、单核细胞增生李斯特菌的检验

食品中单核细胞增生李斯特菌的检验严格依照GB4789.30—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特菌检验》进行。

国家标准中第一法适用于食品中单核细胞增生李斯特菌的定性检验；第二法适用于单核细胞增生李斯特菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特菌的计数；第三法适用于单核细胞增生李斯特菌含量较低（＜100CFU/g）而杂菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特菌的计数，特别是牛乳、水以及含干扰菌落计数的颗粒物质的食品。以下介绍国际第一法。

1.设备和材料(www.xing528.com)

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

冰箱（2～5℃），恒温培养箱（30℃±1℃，36℃±1℃），均质器，显微镜（10×～100×），天平（感量0.1g），锥形瓶（100mL、500mL），无菌吸管（1mL，具0.01mL刻度；10mL，具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头，无菌平皿（直径90mm），无菌试管（16mm×160mm），离心管（30mm×100mm），无菌注射器（1mL）。

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） ATCC19111或CM-CC54004，或其他等效标准菌株；英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua） ATCC33090，或其他等效标准菌株；伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii） ATCC19119，或其他等效标准菌株；斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） ATCC35967，或其他等效标准菌株；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） ATCC25923或其他产β-溶血环金葡菌，或其他等效标准菌株；马红球菌（Rhodococcus equi）ATCC6939或NCTC1621，或其他等效标准菌株。

小白鼠（ICR体重18g～22g）。

全自动微生物生化鉴定系统。

2.培养基及试剂

含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）、李氏增菌肉汤LB（LB₁，LB₂）、1%盐酸吖啶黄（acriflavineHCl）溶液、1%萘啶酮酸钠盐（naladixicacid）溶液、PAL-CAM琼脂、革兰氏染液、SIM动力培养基、缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红（MR）和V-P试验用]、5%～8%羊血琼脂、糖发酵管、过氧化氢试剂、李斯特氏菌显色培养基、生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统、缓冲蛋白胨水。

3.单核细胞增生李斯特菌定性检验

单核细胞增生李斯特菌定性检验程序，如图5-5所示。

图5-5 单核细胞增生李斯特菌定性检验程序

（1）增菌 以无菌操作取样品25g（mL）加入到含有225mLLB₁增菌液的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1～2min；或放入盛有225mL LB₁增菌液的均质杯中，以8000～10000r/min均质1～2min。于30℃±1℃培养24h±2h，移取0.1mL，转种于10mLLB₂增菌液内，于30℃ ±1℃培养24h±2h。

（2）分离 取LB₂二次增菌液划线接种于李斯特菌显色平板和PALCAM琼脂平板，于36℃±1℃培养24～48h，观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；在李斯特菌显色平板上的菌落特征，参照产品说明进行判定。

（3）初筛 自选择性琼脂平板上分别挑取3～5个典型或可疑菌落，分别接种木糖、鼠李糖发酵管，于36℃±1℃培养24h±2h，同时在TSA-YE平板上划线，于36℃±1℃培养18～24h，然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。

（4）鉴定（或选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等）

①染色镜检：李斯特菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.4～0.5μm）×（0.5～2.0μm）；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。

②动力试验：挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺半固体或SIM动力培养基，于25～30℃培养48h，李斯特氏菌有动力，在半固体或SIM培养基上方呈伞状生长，如伞状生长不明显，可继续培养5d，再观察结果。

③生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验。单核细胞增生李斯特菌的主要生化特征见表5-8。

表5-8 单核细胞增生李斯特菌生化特征与其他李斯特菌的区别

续表

注：+阳性；-阴性；V反应不定。

④溶血试验：将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为20～25个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌（单增李斯特菌、伊氏李斯特菌和斯氏李斯特菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特菌），穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36℃±1℃培养24～48h，于明亮处观察，单增李斯特菌呈现狭窄、清晰、明亮的溶血圈，斯氏李斯特菌在刺种点周围产生弱的透明溶血圈，英诺克李斯特菌无溶血圈，伊氏李斯特菌产生宽的、轮廓清晰的β-溶血区域，若结果不明显，可置4℃冰箱24～48h再观察。

注：也可用划线接种法。

⑤协同溶血试验cAMP（可选项目）：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，距离1～2mm，同时接种单核细胞增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、伊氏李斯特菌和斯氏李斯特菌，于36℃±1℃培养24～48h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约2mm的β-溶血增强区域，斯氏李斯特菌也出现微弱的溶血增强区域，伊氏李斯特菌在靠近马红球菌处出现约5～10mm的“箭头状”β-溶血增强区域，英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象。若结果不明显，可置4℃冰箱24～48h再观察。

注：5%～8%的单核细胞增生李斯特菌在马红球菌一端有溶血增强现象。

（5）小鼠毒力试验（可选项目） 将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中，于36℃±1℃培养24h，4000r/min离心5min，弃上清液，用无菌生理盐水制备成浓度为1010CFU/mL的菌悬液，取此菌悬液对3～5只小鼠进行腹腔注射，每只0.5mL，同时观察小鼠死亡情况。接种致病株的小鼠于2～5d内死亡。试验设单增李斯特菌致病株和灭菌生理盐水对照组。单核细胞增生李斯特菌、伊氏李斯特菌对小鼠有致病性。

（6）结果与报告 综合以上生化试验和溶血试验的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特菌。

工作任务实施

沙门氏菌/金黄色葡萄球菌/单增李斯特菌的检测

1.小组讨论，制定检测工作方案，确定人员分工，并填写以下工作文件

2.完成实验准备工作

（1）药品和试剂的准备

（2）实验设备的准备

（3）实验用具的准备

3.检测过程

严格规范检测操作，保证结果的可靠性。

4.结果分析及检测报告的撰写

5.实验后整理