知识准备
【案例导入】
大阪市政府5日宣布的调查结果显示，因食用某乳业公司大阪工厂生产的乳制品而中毒者已逾万人。
在大阪府和京都府以及附近6县，因食用某乳业公司大阪工厂生产的乳制品而中毒发病者已达10628人，其中有155人被送往医院，目前还有37人在医院接受治疗。
据化验，该工厂生产的一些乳制品中含有金黄色葡萄球菌，这种细菌可产生使人出现腹泻、呕吐症状的A型肠毒素。该厂乳制品染菌是生产设备没有按规定定期清洗而造成的。
目前，日本各地超市和食品店都已停止销售雪印牌乳制品，一些地方政府已下令禁止食用此品牌食品。该厂已被当地政府勒令无期限停产，并且大规模回收6月下旬出厂的几种染菌食品。
【问题引导】
什么是金黄色葡萄球菌？
一、金黄色葡萄球菌
葡萄球菌属（Staphylococcus）是一群革兰氏阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状故名为葡萄球菌。该菌属广泛分布于自然界中，绝大多数是非致病菌，有些还构成人和动物皮肤、鼻腔、咽喉等部位的正常菌群，仅有少数具有致病性。
该菌属中与食品关系最为密切的是金黄色葡萄球菌，如图5-3所示。该菌在适宜的条件下会能产生肠毒素，引起人的食物中毒。由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒在我国细菌性食物中毒事件中，仅次于沙门氏菌和副溶血性弧菌。因此，在食品微生物学检验中，必须加以重视。
图5-3 金黄色葡萄球菌
1.生物学特性
（1）形态和染色 该菌为革兰氏阳性球菌，直径为0.5～1.5μm，单个、成对以及不规则的葡萄串状排列，无鞭毛，不运动，无芽孢，一般不形成荚膜。衰老、死亡或被吞噬细胞吞噬的菌体，常转为革兰氏阴性。
（2）培养特性 该菌为需氧或兼性厌氧，在含有20%～30%的CO2环境下有利于产生毒素。该菌对营养要求不高，生长温度7～47.8℃，最适生长温度30～37℃，最适pH7.4。在普通琼脂培养基上生长良好。该菌可耐高盐，在含有10%～15% NaCl环境中仍能生长。
（3）生化反应 葡萄球菌属的生化反应不规则。通常触酶、氧化酶阴性，能发酵多种糖类，产酸不产气，如能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖，有细胞色素。致病菌株能液化明胶，凝固酶试验多为阳性，在厌氧条件下能分解甘露醇并产酸，非致病菌株无此反应。
（4）抵抗力 该菌抵抗力较强，在70℃60min、80℃30min不被杀死，在干燥脓液中能存活数月。5%石炭酸、0.1%生汞15min死亡，70%乙醇数分钟死亡。该菌对龙胆紫敏感。用1%～2%龙胆紫治疗由该菌引起的化脓症的效果很好。
2.分布和传播
金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都能找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%的健康人的皮肤都有其存在。因此，食品受其污染的机会很多。
传播媒介为被该菌污染的食品，主要为淀粉类（如剩饭、米面、粥等），牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。
3.危害
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。
金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取决于其所产生的毒素和侵袭性酶。金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E五种。通常被金黄色葡萄球菌污染的食物，在室温20～22℃放置5h以上时，该菌大量繁殖并产生肠毒素。
（1）肠毒素形成条件
①存放温度，在37℃内，温度越高，产毒时间越短；
②存放地点，通风不良，氧分压低，易形成肠毒素；
③食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。
（2）肠毒素耐受力
①几乎所有的消毒试剂以及热加工过程对金黄色葡萄球菌都有严重的破坏作用。
②肠毒素可耐受100℃30min不被破坏。(www.xing528.com)
③对于加工过的食品或食品加工设备而言，此菌或其肠毒素的存在通常作为卫生条件差的一种指标。
葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。
金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%；加拿大则更多，占45%；我国每年发生的此类中毒事件也非常多。具有季节分布特征，多见于春夏季；中毒食品种类多，如乳、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。
二、金黄色葡萄球菌的检验
食品中金黄色葡萄球菌的检验严格依照GB4789.10—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》进行。
1.基本原理
金黄色葡萄球菌可产生多种毒素和酶。在血平板上生长时，因产生金黄色色素使菌落呈金黄色；由于产生溶血素使菌落周围形成大而透明的溶血圈。在Baird-Parker氏平板上生长时，因将亚碲酸钾还原成碲酸钾使菌落呈灰黑色；因产生脂酶使菌落周围有一浑浊带，而在其外层因产生蛋白水解酶有一透明带。在肉汤中生长时，菌体可生成血浆凝固酶并释放于培养基中（称作游离凝固酶）。此酶类似凝血酶原物质，不直接作用到血浆纤维蛋白原上，而是被血浆中的致活剂（即凝固酶致活因子）激活后，变成耐热的凝血酶样物质，此物质可使血浆中的液态纤维蛋白原变成固态纤维蛋白，血浆因而成凝固状态。
2.设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱（36℃±1℃），冰箱（2～5℃），恒温水浴锅（37℃ ±1℃），天平（感量0.1g），均质器，振荡器，无菌吸管（1mL，具0.01mL刻度；10.0mL，具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头，无菌锥形瓶（容量100mL、500mL），无菌培养皿（直径90mm），涂布棒，pH计或pH比色管或精密pH试纸。
3.培养基及试剂
7.5%氯化钠肉汤，血琼脂平板，Baird-Parker琼脂平板，脑心浸出液（BHI）肉汤，兔血浆，磷酸盐缓冲液，营养琼脂斜面，革兰氏染色液，无菌生理盐水。
4.检验程序
金黄色葡萄球菌检验程序，如图5-4所示。
图5-4 金黄色葡萄球菌检验程序
5.操作步骤
（1）样品的处理 称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌均质杯内，8000～10000r/min均质1～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀。
（2）增菌 将上述样品匀液于36℃±1℃培养18～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。
（3）分离 将增菌后的培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃ ±1℃培养18～24h。Baird-Parker平板36℃ ±1℃培养24～48h。
（4）初步鉴定 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2～3mm，颜色呈灰黑色到黑色，有光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰带。当用接种针接触菌落具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同。从长期保存的冷冻或脱水食品中所分离的菌落，其黑色较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。
（5）确证鉴定
①染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢，无荚膜，直径约为0.5～1μm。
②血浆凝固酶试验：挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5个可疑菌落（小于5个全选），分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，36℃±1℃培养18～24h。
取新鲜配制兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2～0.3mL，振荡摇匀，置36℃ ±1℃温箱或水浴箱内，每0.5h观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。
结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培养18～48h，重复试验。
（6）葡萄球菌肠毒素的检验（选做） 可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应按GB4789.10—2016附录B检测葡萄球菌肠毒素。
（7）结果与报告
①结果判定：符合初步鉴定、确证鉴定的结果，可判定为金黄色葡萄球菌。
②结果报告：在25g（或mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。
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