如何进行沙门氏菌检测？

知识准备

【案例导入】

疫情：美国人生吃西红柿“中毒”

夏天正是新鲜蔬果大量上市的时节，而在大洋彼岸的美国，这个夏天却有不少人因生吃西红柿被“绊倒”了。

据最近统计，目前，美国中西部和南部已有30个州几百人因生食了从墨西哥进口的新鲜西红柿而中毒，出现发烧、腹泻、腹痛等症状，患者中至少48人因病情严重住院，其中1人死亡。生吃西红柿等新鲜的时蔬水果是再平常不过的事了，而且“生食疗法”被视为一种健康的时尚，如今听说生吃蔬果也会中毒，不少人十分着急：到底什么原因引起的食物中毒？

美国疾控中心通过检验发现，吃过这些西红柿的患者检查中都发现了沙门氏菌，看来，这是一起严重的沙门氏菌疫情。

【问题引导】

沙门氏菌是什么？

一、沙门氏菌

沙门氏菌（Salmonella）属是肠杆菌科的一属，因美国病理学家D.E.沙门于1884年发现本属菌中的猪霍乱杆菌而得名，如图5-1所示。沙门氏菌是肠杆菌科中重要的病原菌属，是引起人类和动物发病及食物中毒的主要病原菌之一。在世界各地的食物中毒事件中，证实由沙门氏菌引起的食物中毒一般占前两位，且沙门氏菌还能引起伤寒、副伤寒和败血症等人类疾病。

图5-1 沙门氏菌

沙门氏菌是威胁人类健康的主要病原菌之一，因此在食品微生物学检验中必须加以重视。

1.生物学特性

（1）形态与染色 本属菌是一群抗原构造和生物学性状相似的革兰氏阴性直杆菌，菌体大小（0.5～0.8μm）×（3～4μm），无芽孢，一般无荚膜。除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，一般周身鞭毛，能运动，多数有菌毛，能吸附于宿主细胞表面或凝集豚鼠红细胞。

（2）培养特性 该菌为需氧或兼性厌氧菌，生长温度10～42℃，最适温度37℃，最适pH6.8～7.8。对营养要求不高，在普通琼脂平板上生长良好，培养24h后能形成中等大小、半透明的、表面光滑的菌落，菌落直径一般2～4mm。分离培养常采用肠道选择鉴别培养基。

（3）生化反应 该菌属不发酵乳糖、蔗糖、水杨苷、肌醇和扁桃苷，能发酵葡萄糖、甘露醇、麦芽糖和卫矛糖，不产生吲哚，不分解尿素，不液化明胶，VP试验阴性，大多产生硫化氢，通常赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶反应阳性。脲酶阴性。不产生酯酶和脱氧核糖核酸酶。除伤寒杆菌产酸不产气外，其他沙门氏菌均产酸产气。DNA的G+C含量为50%～53%。

生化反应对沙门氏菌属的鉴别具有重要参考意义，如表5-1所示。根据其生化性状差别，可分为Ⅰ～Ⅴ个亚属。

表5-1 沙门氏菌的生化反应特征

注：-不发酵；×迟缓发酵；+产酸；⊕产酸产气。

（4）抗原结构 该菌属的抗原结构复杂，一般具有菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原和表面抗原（荚膜或包膜抗原）3种抗原。

（5）血清型 该菌属包括2000多个血清型，但多数国家经常分离到的有40～50种血清型。不同血清型的致病力及侵染对象不尽相同，有些对人致病，有些对动物致病，也有些对人和动物都致病。引起人类疾病的沙门氏菌大多属于A、B、C、D、E5个血清群，根据其致病范围，可将其分为3大类群：

第一类群：专门对人致病，如伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，可引起伤寒与副伤寒，统称肠热症。

第二类群：能引起人类食物中毒，称之为食物中毒沙门氏菌群，如鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等最为常见。

第三类群：专门对动物致病，如马流产伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌。此类群很少感染人，但近年来也有感染人的报道出现。

（6）抵抗力 该菌属对热抵抗力不强，在55℃1h、60℃15min可被杀死，在5%的石炭酸中5min死亡。但在外界的生存力较强，在水中能存活2～3周，粪便中能存活1～2月，在牛乳和肉类食品中能存活数月。

2.分布和传播

沙门氏菌广泛分布于自然界，且在人和动物间广泛传播。所有的温血动物和许多冷血动物是沙门氏菌的宿主或潜在宿主。这些带菌动物是动物性食品中沙门氏菌的主要来源。

在沙门氏菌的传播中，病人和带菌者是重要的传染源，也是食品污染的另一来源。从我国饮食行业从业人员带菌检查的结果看，人的沙门氏菌带菌率在1%上下波动，夏秋季可达2%，但冬春季带菌率很低，呈现季节性消长。且从业人员的职业与带菌率有明显的关系，据调查，掌刀的厨师带菌率可高达40%。自带菌者分离的菌株与自动物分离的菌株血清学一致，提示可能是职业性感染。同时，人的带菌又是造成肉类食品污染的重要原因，所以带菌者的因素在沙门氏菌食物中毒中的作用不容忽视。

3.危害

沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。

与人类关系密切的沙门氏菌有：伤寒沙门氏菌（s.typhi），甲、乙、丙型副伤寒沙门氏菌（s.paratyphia、b、c），鼠伤寒沙门氏菌（s.typhimurium），猪霍乱沙门氏菌（s.choleraesuis），肠炎沙门氏菌（s.enteritidis）等十余种。一般可简称伤寒杆菌，甲、乙、丙型副伤寒杆菌，鼠伤寒杆菌，猪霍乱杆菌，肠炎杆菌。

蛋、家禽和肉类产品是沙门氏菌病的主要传播媒介，在食品中增殖，人食入后可在消化道内增殖，引起急性胃肠炎和败血症等。该菌是重要的食物中毒性细菌之一。感染主要取决于沙门氏菌的血清型和食用者的身体状况，受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个体。

它们除可感染人外，还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾病，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。

沙门氏菌是美国食物中毒致死的主要原因。美国人对这种病菌一点都不陌生，每年全国大约报告40000例沙门氏菌感染病例。但实际的感染人数可能要达20倍以上，因为许多轻型病人可能未确诊。据不完全统计，每年大约有1000人死于急性沙门氏菌感染。但是，以前各州爆发的疫情几乎都与人们吃了感染沙门氏菌的肉类、蛋类、乳类有关。

二、沙门氏菌的检验方法

（一）国家标准方法

食品中沙门氏菌的检验方法严格依照GB4789.4—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》进行。

1.基本原理

沙门氏菌属是肠道杆菌科中最重要的病原菌属，它是引起人类和动物发病及食物中毒的主要病原菌之一。食品中沙门氏菌的含量较少，且常由于食品加工过程使其受到损伤而处于濒死的状态。为了分离与检测食品中的沙门氏菌，对某些加工食品必须进行前增菌处理，用无选择性的培养基使处于濒死状态的沙门氏菌恢复活力，再进行选择性增菌，使沙门氏菌得以增殖而大多数的其他细菌受到抑制，然后再进行分离鉴定。

沙门氏菌属是一群血清学上相关的需氧，无芽孢的革兰氏阴性杆菌，周身鞭毛，能运动，不发酵侧金盏花醇、乳糖及蔗糖，不液化明胶，不产生靛基质，不分解尿素，能有规律地发酵葡萄糖并产生气体。沙门氏菌属细菌由于不发酵乳糖，能在各种选择性培养基上生成特殊形态的菌落，而大肠杆菌由于发酵乳糖产酸而出现与沙门氏菌形态特征不同的菌落，如在SS琼脂平板上使中性红指示剂变红，菌落呈红色，借此可把沙门氏菌同大肠杆菌相区别。根据沙门氏菌属的生化特征，借助于三糖铁、靛基质，尿素、KCN、赖氨酸等试验可与肠道其他菌属相鉴别。本菌属的所有菌种均有特殊的抗原结构，借此也可以把它们分辨出来。

食品中沙门氏菌的检验方法有五个基本步骤：前增菌→选择性增菌→选择性平板分离沙门氏菌→生化试验→鉴定到属→血清学分型鉴定。

2.仪器和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：冰箱（2～5℃），恒温培养箱（36℃±1℃，42℃±1℃），均质器，振荡器，电子天平（感量0.1g），无菌锥形瓶（容量100mL、500mL），无菌吸管（1mL，具0.01mL刻度；10.0mL，具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头，无菌培养皿（直径60mm，90mm），无菌试管（3mm×50mm，10mm×75mm），无菌毛细管，pH计或pH比色管或精密pH试纸，全自动微生物鉴定系统（VITEK）。

3.培养基及试剂

缓冲蛋白胨水（BPW），四硫酸钠煌绿（TTB）增菌液，亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液，亚硫酸铋（BS）琼脂，HE（Hektoen Enteric）琼脂，木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂，沙门氏菌属显色培养基，三糖铁（TSI）琼脂，蛋白胨水、靛基质试剂，尿素琼脂（pH7.2），氰化钾（KCN）培养基，赖氨酸脱羧酶试验培养基，糖发酵管，邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基，半固体琼脂，丙二酸钠培养基，沙门氏菌O、H和Vi诊断血清，生化鉴定试剂盒。

4.检验程序

沙门氏菌检验程序如图5-2所示。

图5-2 沙门氏菌检验程序

5.操作步骤

（1）预增菌 无菌操作称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000～10000r/min均质1～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH，用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8～18h。

如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min，或2～5℃不超过18h解冻。

（2）增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃ ±1℃培养18～24h。同时，另取1mL转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18～24h。

（3）分离 分别用直径3mm的接种环挑取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36℃±1℃分别培养18～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征如表5-2所示。

表5-2 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

（4）生化试验

①自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃ ±1℃培养18～24h，必要时可延长至48h，在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果如表5-3所示。

表5-3 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

注：K：产碱，A：产酸；+：阳性，-：阴性；+（-）：多数阳性，少数阴性；+/-：阳性或阴性。(www.xing528.com)

②接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18～24h，必要时可延长至48h，按表5-4判定结果。将已挑菌落的平板储存于2～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。

表5-4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

注：+阳性；-阴性；+/-阳性或阴性。

a.反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表5-5可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。

b.反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

c.反应序号A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

d.必要时按表5-6进行沙门氏菌生化群的鉴别。

表5-5 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

注：+阳性；-阴性。

表5-6 沙门氏菌属各生化群的鉴别

注：+阳性；-阴性。

③如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统，可根据生化试验①的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统进行鉴定。

（5）血清学鉴定

①抗原的准备：一般采用1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2%～3%）培养基上检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.55%～0.65%半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3%～0.4%半固体琼脂的小玻管1～2次，自远端取菌培养后再检查。

②多价菌体抗原（O）鉴定：在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。

③多价鞭毛抗原（H）鉴定：同血清学鉴定②。

④血清学分型（先做）

a.O抗原的鉴定：用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。

被A～F多价O血清凝集者，一次用O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2和O11因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O群。被O3、10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。

不被A～F多价O血清凝集者，先用57种或163种沙门氏菌因子血清中的9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下：

O多价1 A，B，C，D，E，F群（并包括6，14群）

O多价2 13，16，17，18，21群

O多价3 28，30，35，38，39群

O多价4 40，41，42，43群

O多价5 44，45，47，48群

O多价6 50，51，52，53群

O多价7 55，56，57，58群

O多价8 59，60，61，62群

O多价9 63，65，66，67群

b.H抗原的鉴定：属于A～F各O群的常见菌型，依次用表5-7所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。

表5-7 A～F群常见菌型H抗原表

不常见的菌型，先用8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以确定第1相和第2相的H抗原。8种多价H血清所包括的H因子如下：

H多价1 a，b，c，d，i

H多价2 eh，enx，enz₁₅，fg，gms，gpu，gq，mt，gz₅₁

H多价3 k，r，y，z，z₁₀，lv，lw，lz₁₃，lz₂₈，lz₄₀

H多价4 1，2；1，5；1，6；1，7；z₆

H多价5 z₄z₂₃，z₄z₂₄，z₄z₃₂，z₂₉，z₃₅，z₃₆，z₃₈

H多价6 z₃₉，z₄₁，z₄₂，z₄₄

H多价7 z₅₂，z₅₃，z₅₄，z₅₅

H多价8 z₅₆，z₅₇，z₆₀，z₆₁，z₆₂

每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。

检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1～2代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必作位相变异检查。

位相变异试验方法如下：

小玻管法：将半固体管（每管约1～2mL）在酒精灯上熔化并冷至50℃，取已知相的H因子血清0.05～0.1mL，加入于熔化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，待凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检査结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清1∶200～1∶800的量加入。

小倒管法：将两端开口的小玻管（下端开口要留一个缺口，不要平齐）放在半固体管内，小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热熔化，冷至50℃，挑取因子血清1环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，待凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种1%软琼脂斜面，于36℃培养后再做凝集试验。

简易平板法：将0.35%～0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清1环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检査。

c.Vi抗原的鉴定：用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柏林伤寒沙门氏菌。

d.菌型的判定：根据血清学分型鉴定的结果，按照GB4789.4—2016附录B或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。

（6）结果报告 综合以上生化实验和血清学分型鉴定结果，报告25g（或mL）样品中检出或未检出沙门氏菌属。

（二）其他检验方法

1.以抗体为基础的检测方法

利用抗原-抗体反应的显著特异性，来进行细菌的鉴别和血清学定型，已有半个多世纪的历史。细菌菌体或鞭毛抗原的特异性抗体的存在，使得人们可以建立一些快速方法来检测以食品为载体的病原。已经建立的沙门氏菌免疫学检测方法有许多种，大致可分为以酶标抗体（ELISA）、荧光抗体染色（免疫荧光法）、同位素标记抗体（放射免疫试验）为基础的方法及其他多种以抗体为基础，利用乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散及免疫色谱技术的方法。但常规中最广泛采用的是以双位点ELISA技术。此法改进后用有放射活性的同位素替代标记抗体，概括地说，是指以固定在固体基质上的“捕捉”抗体来捕捉目标抗原，经洗涤除去未结合的成分，加入第二种酶标抗体，此者结合在捕捉到的抗原的不同位点上，第二次洗涤后加入酶作用基质，并令其与颜色成分反应，然后用分光光度法即很容易检测到目标抗原。采用微量滴定板作为固态基质使反应形式标准化，并促成其自动化。

2.以核酸为基础的方法

细胞核酸DNA和RNA是唯一一类可以携带信息的大分子。由于所有的细胞都含有这种分子，可以利用它作为检测的标靶。标靶通常是一个特异性核酸序列，它可通过以补体核酸分子作为探针来检出。与免疫学方法相似，探针也需要加附适当的标记，如放射性同位素、酶或发光的标识物。目前有检验人员在食品沙门氏菌检测中引入了第一代DNA-RNA杂交技术，此法应用的探针含有用放射性同位素标记的伤寒沙门氏菌DNA片段，其敏感性高，经大约48h的增菌步骤后，检测极限可达10⁸个细菌/mL，但由于要使用放射性同位素，只能在专门的实验室应用，具有一定的局限性。

以核酸杂交为基础的第二代技术——比色计目前已发展起来。这种方法依赖于沙门氏菌核糖体RNA（rRNA）——核糖体发育过程中储存的核酸成分的检测。核糖体这种天然富含rRNA标靶序列的情况使得用无辐射计检测成为可能，同时又保持了与放射性同位素方法相当或更高的敏感性，其另一优点是由于rRNA为单链（而DNA为双链），杂交前无需经过变性步骤。但针对沙门氏菌检测，需要进行预增菌和选择性增菌，需耗时约50h。

用于检测沙门氏菌和其他以食物为载体的病原的PCR方法业已建立，其中一些方法显示了极好的敏感性。但该法较难自动化，且必须经选择性增菌以稀释可能干扰检测反应的某些成分。一个完整的以PCR为基础的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵销了其高敏感性的优点，但这种方法对那些含沙门氏菌较少或保有沙门氏菌rRNA的样品尤其有效。