知识准备
【案例导入】
腌制品大肠菌群超标10倍 两食品黑作坊被端
昨日，省质量技术监督局捣毁一家生产假冒伪劣产品的食品厂和一家无证无照生产腌腊制品的黑窝点。经查，该食品厂生产现场卫生状况极其恶劣，没有出厂检验设备，其产品大肠菌群等指标超出国家相关标准规定值近10倍。另一违法进行腌腊制品加工的黑作坊既无营业执照和生产许可证，又不具备生产条件。现场腌制的猪心、猪脚、猪舌、火鸡翅膀等涉嫌质量问题成品以及半成品共达5吨多。搜缴出来的加工食品所用的工业用盐共计45袋。执法人员当即对其非法生产的设备、原辅材料和问题产品全部予以没收。
【问题引导】
1.腌腊产品为什么会大肠菌群超标？
2.如何检测大肠菌群？
一、大肠菌群
大肠菌群（coliforms）是指一群在37℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。
大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有无粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。
二、大肠菌群测定的基本原理
大肠菌群MPN法（第一法）就是根据大肠菌群在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的特性而进行检测的方法。MPN，最可能数（most probable number）；基于泊松分布的一种间接计数方法。MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
大肠菌群平板计数法（第二法）是利用大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落特性对待测样品进行菌落计数的方法。
三、大肠菌群测定方法
食品中大肠菌群的检测严格依据GB4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 大肠菌群计数》进行。该标准中第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数；第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。
1.设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
恒温培养箱（36℃±1℃）、冰箱（2～5℃）、恒温水浴箱（46℃±1℃）、天平（感量0.1g）、均质器、振荡器、pH计或pH比色管或精密pH试纸、菌落计数器、无菌吸管（1mL，具0.01mL刻度；10mL，具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶（容量500mL）、无菌培养皿（直径90mm）。
2.培养基和试剂
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤，煌绿乳糖胆盐肉汤，结晶紫中性红胆盐琼脂，无菌磷酸盐缓冲溶液，无菌生理盐水、1mol/LNaOH溶液，1mol/LHCl溶液。
3.大肠菌群MPN计数（第一法）
检验程序见图4-3所示。
图4-3 大肠菌群MPN计数法检验程序
（1）样品的稀释
①固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲溶液或生理盐水的无菌均质杯内，8000～10000r/min均质1～2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。
②液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲溶液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或其他无菌容器中，充分振摇或置于机械振荡器中振摇，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。
③样品匀液的pH应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。
④用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲溶液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。
⑤根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
（2）初发酵试验 每个样品选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验（证实试验），而未产气者则继续培养至48h±2h。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。
（3）复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
（4）大肠菌群最可能数（MPN）的报告 将大肠菌群检验结果（经过确证的大肠菌群BGLB阳性管数）填入大肠菌群检验原始数据表（表4-3），检索MPN表（表4-4），报告每克（或每毫升）样品中大肠菌群的MPN值。(www.xing528.com)
表4-3 大肠菌群检验原始数据表
续表
表4-4 大肠菌群最可能数MPN检索表
注：（1）本表采用3个稀释度[0.1g（或0.1mL）、0.01g（或0.01mL）和0.001g（或0.001mL）]，每个稀释度接种3管。
（2）表内所列举检样量如改用1g（或1mL）、0.1g（或0.1mL）和0.01g（或0.01mL）时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g（或0.01mL）、0.001g（或0.001mL）和0.0001g（或0.0001mL）时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。
4.大肠菌群平板计数（第二法）
大肠菌群平板计数的检验程序如图4-4所示。
图4-4 大肠菌群平板计数的检验程序
（1）样品的稀释 平板计数的样品稀释的操作与MPN法的样品稀释操作一致。
（2）平板计数
①选取2～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌培养皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
②及时将15～20mL熔化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转培养皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18～24h。
（3）平板菌落数的选择 选取菌落数在15～150CFU的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落（如菌落直径较典型菌落小）。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大，最低稀释度平板低于15CFU的记录具体菌落数。
（4）证实试验 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于 BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24～48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
（5）大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或每毫升）样品中大肠菌群数。
例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL） =6.0×105CFU/g（CFU/mL）。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
工作任务实施
（一）食品微生物检验样品的采集与处理
1.小组讨论，制定采样工作方案，确定人员分工，并填写以下工作文件
2.对采集样品和预处理过程进行登记备查
注：请务必认真填写此表，标★为采样方填写项目，如没有该项，可用“/”表示。
本委托书一式两份，填写页采样方保存，复写页样品单位保存。
1.小组讨论，制定检测工作方案，确定人员分工，并填写以下工作文件
2.完成实验准备工作
（1）药品和试剂的准备
（2）实验设备的准备
（3）实验用具的准备
3.检测过程
严格规范检测操作，保证结果的可靠性。
4.结果分析及检测报告的撰写
续表
5.实验后整理
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