四川润泉水业的菌落总数检验与评价

知识准备

【案例导入】

桶装水菌落总数超标

近日，四川省卫生执法监督总队在成都市、遂宁市、南充市、德阳市、乐山市各桶装水销售点进行了监督抽检，抽检的35个样品中，9个生产厂家的10批次产品不合格。在这份“黑名单”中，大名鼎鼎的“怡宝优质天然矿泉水”和“润全饮用天然矿泉水”尤为显眼。

据四川省卫生厅公布的资料显示，此次抽检不合格的指标主要是菌落总数超标。按照国家规定，矿泉水的菌落总数不超过50CFU/mL。令人吃惊的是，生产日期为6月7日的“润全饮用天然矿泉水”的菌落总数达到了1700CFU/mL，超标30倍以上；而在同一地点生产的“怡宝优质天然矿泉水”，菌落总数也达到110CFU/mL。

四川省卫生厅执法人员随后对菌落总数超标严重的四川润泉水业有限公司进行了突击检查。在该公司位于成都龙泉驿区十陵镇中街336号的生产现场，执法人员发现，其卫生状况存在不少问题：空桶存放于半露天的场所里，洗桶车间和包装车间工作人员未着工作服上岗，消毒的泡靴池根本没有消毒水，灌装间铝合金门破损，天花板上有三处缺损，卫生设施不到位。

执法人员进一步检查还发现，该公司的卫生许可证今年5月10日已过期，这意味着该公司无证生产已有两个多月。执法人员当即对生产现场的生产设备、产品进行了查封。

【问题引导】

1.菌落总数超标有什么危害？

2.如何检测桶装水的菌落总数？

一、菌落总数的概念

食品中菌落总数的测定，目的在于了解食品生产中，从原料加工到成品包装受外界污染的情况；也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，确定食品的保存期，以便对被检样品进行安全学评价时提供依据。

食品有可能被多种类群的微生物所污染，每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件去满足其要求，才能分别将各种细菌培养出来。但在实际工作中，一般都只用一种常规方法进行菌落总数测定，所得结果只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌的菌落数。

1.菌落

菌落指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。

2.菌落总数

菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含细菌菌落总数。即指一定数量或面积的食物样品，在一定条件下进行细菌培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，然后进行菌落计数所得的菌落数量。在我国的食品安全标准中，采用的测定食品中细菌数量的方法，是在严格规定的培养方法和培养条件（样品处理、培养基种类及其pH、培养温度与时间、计数方法等）下进行的，使得适应这些条件的每一个活菌细胞能够生成一个肉眼可见的菌落，所生成的菌落总数即是该食品中的细菌总数。用此法测得的结果，常用CFU表示。

按国家标准方法规定，在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数。所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数、需氧菌数等。

二、菌落总数测定的意义

菌落总数是食品安全指标中的重要项目，主要作为判定食品被污染程度的标志，也可应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行安全学评价时提供依据。

从食品安全观点来看，食品中菌落总数越多，说明食品质量越差，即病原菌污染的可能性越大。食品中菌落总数的多少，直接反映着食品的安全质量。如果食品中菌落总数多于10万个，就足以引起细菌性食物中毒；如果人的感官能察觉食品因细菌的繁殖而发生变质时，细菌数已达到10⁶～10⁷个/g（mL或cm²）。但不能单凭菌落总数一项指标来评定食品安全质量的优劣，必须配合大肠菌群和病原菌项目的检验，才能对食品作出比较全面准确的评价。

菌落总数还可用来预测食品可存放的期限。食品中细菌数量越少，食品存放的时间就越长，相反，保质期就短。

三、菌落总数的检测

食品中菌落总数的检验方法严格依照GB4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数检测》进行。

1.基本原理

菌落总数是作为判定食品的清洁程度（被污染程度）的标记，通常越干净的食品，单位样品菌落总数越低。反之，菌落总数就越高。菌落总数的测定是以每个活细菌能增殖形成一个可见的单独菌落为基础的，但是在实践操作中除了单个细胞形成菌落外，两个或两个以上相连的同种细胞也同样可形成菌落，所以现在均以菌落总数（而不是活细菌数）或菌落形成单位数表达。

由于菌落总数的测定是在37℃有氧条件下培养的结果，对于厌氧菌、微需氧菌、嗜冷菌和嗜热菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的细菌也受到限制。因此，这种方法所得到的结果，实际上只包括一群在普通营养琼脂中发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。但由于在自然界中这类细菌占大多数，其数量的多少能反映出样品中细菌的总数，正因为如此，用该方法来测定食品中含有的细菌总数已得到了广泛的认可。

2.仪器和材料

恒温培养箱（36℃ ±1℃，30℃ ±1℃）、冰箱（2～5℃）、恒温水浴锅（46℃±1℃）、天平（感量0.1g）、均质器、振荡器、pH计或pH比色管或精密pH试纸、放大镜或（和）菌落计数器。无菌吸管（1mL，具0.01mL刻度；10mL，具0.1mL刻度）或微量移液器及相应吸头、无菌锥形瓶（容量250mL、500mL）、灭菌平皿（直径90mm）、试管、酒精灯、试管架、灭菌剪刀、灭菌镊子。

3.培养基及试剂

平板计数琼脂培养基、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水。

4.检验程序

菌落总数检验程序如图4-2所示。

（1）样品的稀释及接种(www.xing528.com)

①固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000～10000r/min均质1～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。

图4-2 菌落总数的检验程序

②液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。

③用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。

④按③操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。

⑤根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

⑥及时将15～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

（2）培养 待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h。

如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按上述培养条件进行培养。

（3）菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。

①选取菌落数在30～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

②其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

③当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

（4）菌落结果的计算

①若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（毫升）样品中菌落总数结果。

②若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（4-1）计算：

式中 N——样品中菌落数；

∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n₁——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n₂——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

【例】已知第一稀释度为1∶100，菌落数为232、244；第二稀释度为1∶1000，菌落数为33、35，则该样品的菌落总数为：

将24727按要求修约后，表示为25000或2.5×10⁴。

③若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

④若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

⑤若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

⑥若所有稀释度的平板菌落数均不在30～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

（5）菌落总数的报告

①菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。

②菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

③若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

④若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

⑤称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。