如何检测霉菌和酵母：影响因素和实验结果解析

知识准备

【案例导入】

抽检发现：食品霉菌超标120倍

市质监局近期对本市生产、销售的糕点、饼干、面包和炒货等4类共411种食品开展了抽查，曝光多家质量问题严重的食品及其企业，其中广东××食品有限公司9月27日生产的金禾牌蛋酥（160g/件），其霉菌计数超标3倍多；上海××工贸有限公司12月25日生产的企强牌糖衣花生仁（202g/件），其霉菌计数超标高达120倍。对抽查不合格的产品，本市质监部门已要求销售单位撤柜，涉及本市生产企业的已督促企业主动召回，对质量问题严重的企业已立案查处，将依法做出行政处罚。

【问题引导】

1.霉菌超标对人体有哪些危害？

2.如何检测食品中的霉菌？

一、霉菌

1.霉菌的生长条件

影响霉菌生长繁殖及产毒的因素是很多的，与食品关系密切的有水分、温度、基质、通风等条件，控制这些条件，可以相应的控制霉菌在食品中的生长和产毒。

（1）水分 霉菌生长繁殖主要的条件之一是必须保持一定的水分，一般来说，米麦类水分在14%以下，大豆类在11%以下，干菜和干果品在30%以下，微生物是较难生长的。食品中真正能被微生物利用的那部分水分又称为水分活度（A_w）。A_w越接近于1，微生物越易生长繁殖。食品中的A_w为0.98时，微生物最易生长繁殖，当A_w降为0.93以下时，微生物繁殖受到抑制，但霉菌仍能生长，当A_w在0.7以下时，则霉菌的繁殖受到抑制，可以阻止产毒的霉菌繁殖。

（2）温度 温度对霉菌的繁殖及产毒均有重要的影响，不同种类的霉菌其最适温度是不一样的，大多数霉菌繁殖最适宜的温度为25～30℃，在0℃以下或30℃以上，不能产毒或产毒力减弱。如黄曲霉的最低繁殖温度范围是6～8℃，最高繁殖温度是44～46℃，最适生长温度37℃左右。但产毒温度则不一样，略低于生长最适温度，如黄曲霉的最适产毒温度为28～32℃。

（3）食品基质 与其他微生物生长繁殖的条件一样，不同的食品基质中霉菌生长的情况是不同的，一般而言，营养丰富的食品其霉菌生长的可能性大，天然基质比人工培养基产毒好。实验证实，同一霉菌菌株在同样培养条件下，以富于糖类的小麦、米为基质比油料为基质的黄曲霉毒素产毒量高。另外，缓慢通风较快速风干霉菌容易繁殖产毒。

（4）霉菌种类 不同种类的霉菌其生长繁殖的速度和产毒的能力是有差异的。霉菌毒素中毒性最强者有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、黄绿青霉素、红色青霉素及青霉酸。目前已知有五种毒素可引起动物致癌，它们是黄曲霉毒素（B₁、G₁、M₁）、黄天精、环氯素、杂色曲霉素和展青霉素。

2.霉菌对人体健康的危害

（1）霉菌能引起食物霉变，人食用霉变食物后，或直接引起中毒，或产生的毒素能够致癌。在自然界中，霉菌有3万多种，而且分布很广，其中大约有200多种可致癌，常见的有黄曲霉菌、镰刀菌。

（2）霉菌能引发感染。霉菌直接在人体内繁殖，引起霉菌性肺炎等疾病，多见于一些久病体弱者。

（3）霉菌能引起的过敏性疾病，如支气管哮喘、皮炎等。来自美国谷物协会的资料指出，从2002年以来霉菌毒素对全世界猪业的危害日渐突出。全世界的谷物有25%以上受到霉菌毒素污染，我国的这种污染更严重，中国农科院畜牧所于21世纪初的一项调查表明，配合饲料中不同程度的霉菌毒素的污染率高达80%以上，这显示生猪中少有霉菌饲料危害的幸免者。正因为霉菌毒素存在于饲料中的普遍性和对猪只组织器官损害的广泛性，是许多传染病与非传染病发生的始动环节，而成为比许多传染病危害更严重的慢性耗损性疾病。

3.霉菌的预防

霉菌在我们的生活中无处不在，比较青睐于温暖潮湿的环境，一有合适的环境就会大量的繁殖，必须采取措施来阻止霉菌的繁殖或切断其传播途径，才可以摆脱霉菌的感染。

（1）注意身体某部位霉菌的滋生，比如指甲，有时霉菌会侵入指甲造成灰指甲，所以指甲不要留长，经常清理。多汗的皮肤褶皱里，特别是胖人皮肤褶皱比较多，如果是夏季出汗多，有可能在褶皱处滋生霉菌。还有就是脚部也是霉菌滋生的有利环境，有脚气的人就更应该注意，防止引起其他部位感染。

（2）自己的内裤要单独洗，特别是家人或自己有足癣或灰指甲时更应该注意，为了防止交叉感染都应该分开来洗。

（3）不要滥用抗生素，大量吃抗生素可能会将有益人体健康的菌群抑制住，破坏人体的天然防御屏障，造成霉菌的大量繁殖。

（4）警惕洗衣机中隐藏霉菌，洗衣机用的久了肯定会滋生霉菌，最简单的方法就是用60度左右的水来彻底清洗。同时洗完的衣物一定要在太阳下晾晒，阳光中的紫外线可以杀死残存的霉菌。

（5）在公共场所最好不要用公用的或者别人用过的洗具。同时选用适宜的个人清洁护理产品。

（6）正确的避孕，避孕药中的雌激素有促进霉菌侵袭的作用。如果反复发生霉菌性阴道炎，就尽量不要使用药物避孕。

（7）内裤最好选择棉质的，紧身化纤内裤会使阴道局部的温度及湿度增高，有利于霉菌生长。

（8）如果患有霉菌性阴道炎，自己治疗的同时，男方也应同时接受治疗，避免交叉感染。

（9）控制血糖，碱性产品清洗外阴。女性糖尿病人阴道糖原含量和酸度偏高，易于被霉菌侵害。所以，在控制血糖的同时，还要注意清洗外阴，选用pH弱碱性产品。

二、酵母菌（yeast）

酵母菌在自然界分布广泛，主要生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如，在水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。

1.酵母菌的生长条件

（1）营养 酵母菌同其他活的有机体一样需要相似的营养物质，像细菌一样，它有一套胞内和胞外酶系统，用以将大分子物质分解成细胞新陈代谢容易利用的小分子物质。

（2）水分 像细菌一样，酵母菌必须有水才能存活，但酵母需要的水分比细菌少，某些酵母能在水分极少的环境中生长，如蜂蜜和果酱，这表明它们对渗透压有相当高的耐受性。

（3）酸度 酵母菌能在pH为3.0～7.5的范围内生长，最适 pH为4.5～5.0。

（4）温度 在低于水的冰点或者高于47℃的温度下，酵母细胞一般不能生长，最适生长温度一般在20～30℃。

（5）氧气 酵母菌在有氧和无氧的环境中都能生长，即酵母菌是兼性厌氧菌。在缺氧的情况下，酵母菌把糖分解成酒精和二氧化碳；在有氧的情况下，它把糖分解成二氧化碳和水。有氧存在时，酵母菌生长较快。

2.酵母产品的种类

酵母产品有几种分类方法。以人类食用和作动物饲料的不同目的可分成食用酵母和饲料酵母。食用酵母中又分成面包酵母、食品酵母和药用酵母等。

（1）面包酵母 又分压榨酵母、活性干酵母和快速活性干酵母。

①压榨酵母：采用酿酒酵母生产的含水分70%～73%的块状产品。呈淡黄色，具有紧密的结构且易粉碎，有强的发面能力。在4℃可保藏1个月左右，在0℃能保藏2～3个月，产品最初是用板框压滤机将离心后的酵母乳压榨脱水得到的，因而被称为压榨酵母，俗称鲜酵母。发面时，其用量为面粉量的1%～2%，发面温度为28～30℃，发面时间随酵母用量、发面温度和面团含糖量等因素而异，一般为1～3h。

②活性干酵母：采用酿酒酵母生产的含水分8%左右、颗粒状、具有发面能力的干酵母产品。采用具有耐干燥能力、发酵力稳定的酵母经培养得到鲜酵母，再经挤压成型和干燥而制成。发酵效果与压榨酵母相近。产品用真空或充惰性气体（如氮气或二氧化碳）的铝箔袋或金属罐包装，货架寿命为半年到1年。与压榨酵母相比，它具有保藏期长，不需低温保藏，运输和使用方便等优点。

③快速活性干酵母：一种新型的具有快速高效发酵力的细小颗粒状（直径小于1mm）产品。水分含量为4%～6%。它是在活性干酵母的基础上，采用遗传工程技术获得高度耐干燥的酿酒酵母菌株，经特殊的营养配比和严格的增殖培养条件以及采用流化床干燥设备干燥而得。与活性干酵母相同，采用真空或充惰性气体保藏，货架寿命为1年以上。与活性干酵母相比，颗粒较小，发酵力高，使用时不需先水化而可直接与面粉混合加水制成面团发酵，在短时间内发酵完毕即可焙烤成食品。该产品在20世纪70年代才在市场上出现，深受消费者的欢迎。

（2）食品酵母 不具有发酵力和繁殖能力，供人类食用的干酵母粉或颗粒状产品。它可通过回收啤酒厂的酵母泥或为了人类营养的要求专门培养并干燥而得。美国、日本及欧洲一些国家在普通的粮食制品如面包、蛋糕、饼干和烤饼中掺入5%左右的食用酵母粉以提高食品的营养价值。酵母自溶物可作为肉类、果酱、汤类、乳酪、面包类食品、蔬菜及调味料的添加剂；在婴儿食品、健康食品中作为食品营养强化剂。从安琪酵母中提取的浓缩转化酶用作方蛋夹心巧克力的液化剂。从以乳清为原料生产的酵母中提取的乳糖酶，可用于牛乳加工以增加甜度，防止乳清浓缩液中乳糖的结晶，适应乳糖不耐症的消费者的需要。(www.xing528.com)

（3）药用酵母 制造方法和性质与食品酵母相同。由于它含有丰富的蛋白质、维生素和酶等生理活性物质，医药上将其制成酵母片，如食母生片，用于治疗因不合理的饮食引起的消化不良症。体质衰弱的人服用后能起到一定程度的调整新陈代谢机能的作用。在酵母培养过程中，如添加一些特殊的元素制成含硒、铬等微量元素的酵母，对一些疾病具有一定的疗效。如含硒酵母用于治疗克山病和大骨节病，并有一定防止细胞衰老的作用；含铬酵母可用于治疗糖尿病等。

（4）饲料酵母 通常用假丝酵母或脆壁克鲁维酵母经培养、干燥制成不具有发酵力、细胞呈死亡状态的粉末状或颗粒状产品。它含有丰富的蛋白质（30%～40%）、B族维生素、氨基酸等物质，广泛用作动物饲料的蛋白质补充物。它能促进动物的生长发育，缩短饲养期，增加肉量和蛋量，改良肉质和提高瘦肉率，改善皮毛的光泽度，并能增强幼禽畜的抗病能力。

3.酵母的危害

（1）腐生性酵母菌能使食物、纺织品和其他原料腐败变质；

（2）少数耐高渗的酵母菌和鲁氏酵母、蜂蜜酵母可使蜂蜜和果酱等败坏；

（3）有的酵母菌是发酵工业的污染菌，影响发酵的产量和质量；

（4）某些酵母菌会引起人和植物的病害，例如白假丝酵母可引起皮肤、黏膜、呼吸道、消化道等多种疾病。

三、霉菌和酵母的检验

本方法严格依据GB4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》进行。

1.检验范围

检验标准中规定了食品中霉菌和酵母的计数方法，其中第一法适用于各类食品中霉菌和酵母的计数，第二法适用于番茄酱罐头、番茄汁中霉菌的计数。

2.基本原理

标准中的第一法主要采用的使平板菌落计数法对食品中的霉菌和酵母进行培养后计数。平板菌落计数是根据微生物在高浓度稀释条件下固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞（孢子）繁殖而成这一培养特征设计的计数方法。先将待测定的微生物样品按比例作一系列的稀释后，再吸取一定量某几个稀释度的菌液于无菌培养皿中，及时到入培养基，立即摇匀。经培养后，将各平板中计得的菌落数乘以稀释倍数，即可测知单位体积的原始菌样中所含的活菌数。

稀释平板菌落计数法既可定性又可定量，既可用于微生物的分离纯化又可用于微生物的数量测定，霉菌和酵母计数与菌落总数测定均采用此方法进行。以下对霉菌和酵母的计数检验均以国家标准第一法为例进行。

3.实验材料

恒温培养箱（28℃±1℃），拍击式均质器及均质袋，显微镜（10×～100×），电子天平（感量0.1g），无菌锥形瓶（500mL、250mL）无菌吸管（1mL，具0.01mL刻度；10mL，具0.1mL刻度），无菌平皿（直径90mm），无菌试管（18mm×180mm），恒温水浴箱（46℃±1℃）等。

4.培养基

马铃薯葡萄糖琼脂，孟加拉红琼脂，生理盐水，磷酸盐缓冲液。

5.检验程序

霉菌和酵母计数的检验程序如图4-1所示。

图4-1 霉菌和酵母计数的检验程序

6.操作步骤

（1）样品稀释

①固体和半固体样品：称取25g样品，加入225mL无菌稀释液（蒸馏水或生理盐水或磷酸盐缓冲液），充分振摇，或用拍打式均质器拍打1～2min，即为1∶10样品匀液。

②液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL无菌稀释液（蒸馏水或生理盐水或磷酸盐缓冲液）的适宜容器内（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或无菌均质袋中，充分振摇或用拍打式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。

③取1mL1∶10样品匀液注入含有9mL无菌稀释液的试管中，另换一支1mL无菌吸管反复吹吸，或在旋涡混合器上混匀，此液为1∶100样品匀液。重复此操作，依次制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1支1mL无菌吸管。

④根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL无菌稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。

⑤及时将20～25mL冷却至46℃的马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红琼脂（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀，置水平台面待培养基完全凝固。

（2）培养 琼脂凝固后，正置平板，置28℃±1℃温箱中培养，观察并记录培养至第5d的结果。

（3）菌落计数 肉眼观察，必要时可用放大镜或低倍镜，记录稀释倍数和相应的霉菌和酵母菌落数。以菌落形成单位（colony forming units，CFU）表示。选取菌落数在10～150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为菌落蔓延。

（4）结果

①计算同一稀释度的两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数。

②若有两个稀释度平板上菌落数均在10～150CFU之间，则按照GB 4789.2—2016的相应规定进行计算。

③若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

④若所有平板上菌落数均小于10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

⑤若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

⑥若所有稀释度的平板菌落数均不在10～150CFU之间，其中一部分小于10CFU或大于150CFU时，则以最接近10CFU或150CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

（5）报告

①菌落按“四舍五入”原则修约，菌落数在10以内时，采用一位有效数字报告；菌落数在10～100之间时，采用两位有效数字报告。

②菌落数大于或等于100时，前第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。

③若空白对照平板上有菌落出现，则此次检测结果无效。

④称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。