知识准备
【案例导入】
关于加拿大李氏杆菌食品中毒事件
新华网渥太华（2008年）8月25日电 加拿大农业和粮食部长格里·里茨25日说，由被污染肉食产品引发的李氏杆菌病已在加拿大造成12人死亡。
里茨在渥太华举行的新闻发布会上说，防疫人员24日曾报告死于此次李氏杆菌病疫情的患者为4人，但有关官员25日修订了统计标准，将该病只是部分致死原因的死亡病例都统计在内，使这个数字增加到12人。据里茨证实，近日加拿大全国已确诊的李氏杆菌病病例为26个，另有29个疑似病例。
加拿大卫生部门此前已确认这次疫情与加拿大的食品公司——枫叶食品公司的肉食产品受污染有关。25日，枫叶公司宣布把召回的产品种类增至220多个。同日，卢塞恩食品公司也宣布在加拿大全国范围内召回该公司的28种三明治产品，因为它们的制作原料中都含有枫叶公司的肉食产品。
【问题引导】
1.如何采集怀疑污染的样品？
2.采集后的检验如何进行处理？
一、采样前的准备工作
（2）各种玻璃器皿需刷洗干净灭菌，冷却后备用。
（4）无菌室灭菌，必要时进行无菌室的空气检验，把琼脂平板暴露在空气中15min，培养后每个平板上不得超过15个菌落。
（5）检验人员的工作衣、帽、鞋、口罩等灭菌后备用。
二、样品采集原则
（1）根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案。
（2）应采用随机原则采样，确保所采集的样品具有代表性。以检验结果的准确性来说，样品的代表性及其状态是关键，如果取样没有代表性，得出的检验结果可能毫无意义。
（3）采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。
（4）样品在保存和运输的过程中，应采取一切必要的措施防止样品中原有的微生物数量变化，保持样品的原有状态。
（5）采样标签应完整、清楚：采集样品的样品名称、批次、采样号、采集日期、附加样品号、采样人以及采样时样品的温度、采样地点等，一并记录在检验员的说明中。
三、食品微生物检验的采样方案
1.原理
不同国家或地区有不同的食品微生物检验的采样方案，其中有国际食品微生物标准委员会（ICMSF）采样方案、美国食品与药物管理局（FDA）采样方案、联合国粮农组织（FAO）采样方案。
我国的采样方案遵循GB4789.1—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则》。该标准规定了采样原则分为二级法和三级法，这一方法来自于国际食品微生物标准委员会（ICMSF）提出的ICMSF采样方案，其实质是根据以下几个因素来设定抽样方案并规定其不同采样数的。
（1）各种微生物本身对人的危害程度各有不同。
（2）食品经不同条件处理后，其危害度变化情况：降低危害度、危害度未变、增加危害度。目前，加拿大、以色列等很多国家已采用此法作为国家标准，我国也采用此法。
2.采样方案
依据事先给食品进行的危害程度划分来确定，将所有食品分成三种危害度：
Ⅰ类危害是指老人和婴幼儿食品及在食用前可能会增加危害的食品；
Ⅱ类危害是指可立即食用的食品，在食用前危害基本不变；
Ⅲ类危害是指食用前经加热处理，危害减小的食品。
根据危害度的分类，将采样方案分为二级法和三级法。二级采样方案设有n、c、和m值，三级采样方案设有n、c、m和M值。在中等或危害严重的情况下使用二级采样方案，对健康危害低的则建议使用三级采样方案，如表4-1所示。
表4-1 ICMSF按微生物指标的重要性和食品危害度分类后确定的取样方案
注：（1）n—同一批次产品应采集的样品件数；
c—最大可允许超出m值的样品数；
m—微生物指标可接受水平的限量值；
M—微生物指标的最高安全限量值。
（2）按照二级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值大于m值。
（3）按照三级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许全部样品中相应微生物指标检验值小于或等于m值；允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值在m值和M值之间；不允许有样品相应微生物指标大于M值。
由于ICMSF是将微生物的危害度、食品的特性及处理条件三者综合在一起进行食品中微生物危害分类的，这个取样方案很科学，符合实际情况，对生产厂及消费者来说都是比较合理的。
例如：n=5，c=2，m=100CFU/g，M=1000CFU/g。
其含义是：从一批产品中采集5个样品，若5个样品的检验结果均小于或等于m值（≤100CFU/g），则这种情况是允许的；若≤2个样品的结果（X）位于m值和M值之间（100CFU/g≤X≤1000CFU/g），则这种情况也是允许的；若有3个及以上样品的检验结果位于m值和M值之间，则这种情况是不允许的；若有任一样品的检验结果大于M值（＞1000CFU/g），则这种情况也是不允许的。
3.各类食品的采样方法
采样应遵循无菌操作程序，采样工具和容器应无菌、干燥、防漏，形状及大小适宜。
（1）即食类预包装食品 取相同批次的最小零售原包装，检验前要保持包装的完整，避免污染。
（2）非即食类预包装食品 原包装小于500g的固态食品或小于500mL的液态食品，取相同批次的最小零售原包装；大于500mL的液态食品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均质后分别从相同批次的n个容器中采集5倍或以上检验单位的样品；大于500g的固态食品，应用无菌采样器从同一包装的几个不同部位分别采取适量样品，放入同一个无菌采样容器内，采样总量应满足微生物指标检验的要求。
（3）散装食品或现场制作食品 根据不同食品的种类和状态及相应检验方法中规定的检验单位，用无菌采样器现场采集5倍或以上检验单位的样品，放入无菌采样容器内，采样总量应满足微生物指标检验的要求。
（4）食源性疾病及食品安全事件的食品样品 采样量应满足食源性疾病诊断和食品安全事件病因判定的检验要求。微生物对储存和运输中诸如温度或持续时间等因素较敏感，所以实验室在接受样品时应检查并记录样品状况。
四、采集样品的标记
（1）应对采集的样品进行及时、准确的记录和标记，采样人应清晰填写采样单（包括采样人、采样地点、时间，样品名称、来源、批号、数量、保存条件等信息）。
（2）采集样品的贮存和运输：采样后，应将样品在接近原有贮存温度条件下尽快送往实验室检验。运输时应保持样品完整。如不能及时运送，应在接近原有贮存温度条件下贮存。
五、样品处理
（1）实验室接到送检样品后，应认真核对登记，确保样品的相关信息完整并符合检验要求。
（2）实验室应按要求尽快检验。若不能及时检验，应采取必要的措施保持样品的原有状态，防止样品中目标微生物因客观条件的干扰而发生变化。
（3）冷冻食品应在45℃以下不超过15min，或2～5℃不超过18h解冻后进行检验。
（4）不合格样品处理：如果样品数量不足，或因外观不整、温度不适、包装破损导致样品状态不佳，或标识缺失，实验室应在决定检测或拒绝接受样品前与客户沟通。在任何情况下，样品的状况应在检测报告中体现。
六、检验方法的选择
（1）应选择现行有效的国家标准方法。
（2）食品微生物检验方法标准中对同一检验项目有两个及两个以上定性检验方法时，应以常规培养方法为基准方法。
（3）食品微生物检验方法标准中对同一检验项目有两个及两个以上定量检验方法时，应以平板计数法为基准方法。
七、常见样品的采取(www.xing528.com)
1.采样工具与容器
（1）采样工具 采样工具应使用不锈钢或其他强度适当的材料，表面光滑，无缝隙，边角圆润。采样工具应便于清洗和灭菌，在使用前经过干燥灭菌。采样工具包括搅拌器具、采样勺、匙、切割丝、刀具（小刀或抹刀）、采样钻等。
（2）采样容器 样品容器的材料（如玻璃、不锈钢、塑料等）和结构应能充分保证样品的原有状态。容器和盖子应清洁、无菌、干燥。样品容器应有足够的容积，使样品可在测试前充分混匀。样品容器还包括采样带、采样管、采样瓶等。
除此之外，采样时还应携带温度计、铝箔、封口膜、记号笔、采样登记表等。
2.乳及乳制品的采样
（1）生乳的采样
①样品应充分搅拌混匀，混匀后应立即取样，用无菌采样工具分别从相同批次（此处特指单体的贮奶罐或贮奶车）中采集n个样品，采样量应满足微生物指标检验的要求。
②具有分隔区域的贮奶装置，应根据每个分隔区域内贮奶量的不同，按比例从中采集一定量经混合均匀的代表性样品，将上述奶样混合均匀。
（2）液态乳制品的采样 适用于巴氏杀菌乳、发酵乳、调制乳等产品。取相同批次最小零售原包装，每批至少取n件。
（3）半固态乳制品的采样 适用于炼乳等产品。
①原包装小于或等于500g（mL）的制品，取相同批次的最小零售原包装，每批至少取n件。采样量不少于5倍最少检验需要量或以上检验单位的样品。
②原包装大于500g（mL）的制品，采样前应摇动或使用搅拌器搅拌，使其达到均匀后采样。如果样品无法进行混合，就从样品容器中的各个部位取代表性样。采样量不少于5倍最少检验需要量或以上检验单位的样品。
③原包装大于1000g（mL）的制品，采样前应摇动或使用搅拌器搅拌，使其达到均匀后采样。对于固态制品，用无菌刀除去表层产品，厚度不少于5mm。将洁净、干燥的采样钻沿包装容器切口方向往下均匀穿入底部，再将采样钻旋转180°，抽出采样钻并将采集到的样品转入样品容器。采样量不少于5倍最少检验需要量或以上检验单位的样品。
（4）固态乳制品的采样 适用于干酪、再制干酪、乳粉、乳清粉、乳糖和酪乳粉等。
①原包装小于或等于500g（mL）的制品，取相同批次的最小零售原包装，采样量不少于5倍最少检验需要量或以上检验单位的样品。
②原包装大于500g（mL）的制品，例如干酪产品，根据干酪的形状和类型，可分别使用以下方法：
Ⅰ在距边缘不小于10cm处，把取样器向干酪中心斜插到一个平表面，进行一次或几次；
Ⅱ把取样器垂直插入一个面，并穿过干酪中心到对面；
Ⅲ从两个平面之间，将取样器水平插入干酪的竖直面，插向干酪中心；
Ⅳ若干酪是装在桶、箱或其他容器中，或是将干酪制成压紧的大块时，将取样器从容器顶斜穿到底进行采样。采样量不小于5倍最少检验需要量或以上检验单位的样品。
3.肉与肉制品的采样
（1）生肉及脏器的取样 如系屠宰后的畜肉，可于开腔后，用无菌刀取两腿内侧肌肉各150g（或劈半后采取两侧背最长肌各150g）；如系冷藏或售卖的生肉，可用无菌刀取腿肉或其他部位之肌肉250g。检样采取后，放入灭菌容器内，立即送检；如条件不许可时，最好不超过3h，送检样时应注意冷藏，不得加入任何防腐剂。检样送往化验室应立即检验或放置冰箱暂存。
（2）禽类（包括家禽和野禽） 鲜、冻家禽采取整只，放灭菌容器内。带毛野禽可放清洁容器内，立即送检。
（3）各类熟肉制品（包括酱卤肉、肴肉、肉灌肠、烧烤肉、肉松、肉脯、肉干等） 一般采取250g；熟禽采取整只，均放灭菌容器内，立即送检。
（4）腊肠、香肚等生灌肠 采取整根、整只、小型的可采数根数只，其总量不少于250g。
（5）棉拭采样法 检验肉禽及其制品受污染的程度，一般可用孔板5cm2的金属制规板压在受检物上，将灭菌棉拭稍沾湿，在板孔5cm2的范围内揩抹多次，然后将板孔移压另一点，用另一棉拭揩抹，如此共移压揩抹10次，总面积为50cm2，共用10只棉拭。每只棉拭在揩抹完毕后应立即剪断或烧断后投入盛有50mL灭菌水的三角瓶或大试管中，立即送检。检验时先充分振摇，吸取瓶、管中的液体为原液，再按要求做10倍递增稀释。检验致病菌，不必用规板，可疑部位用棉拭即可。
4.其他食品样品的采集
各类食品微生物检验的样品采集与处理都有相应的国家标准（见附录一），采样时要严格按照国标操作。
八、样品采集后的处理
1.乳与乳制品检样的处理
（1）鲜乳、酸乳 塑料或纸盒（袋）装，用75%酒精棉球消毒盒盖或袋口，玻璃瓶装酸乳以无菌操作去掉瓶口的纸罩、纸盖，瓶口经火焰消毒，用无菌操作吸取25mL检样，放入装有225mL灭菌生理盐水的锥形瓶内，振摇均匀（酸乳如有水分析出于表层，应先除去）。
（2）炼乳 将瓶或罐先用温水洗净表面，再用点燃的酒精棉球消毒瓶或罐的上部，然后用灭菌的开罐器打开罐或瓶，以无菌操作称取25g（mL）检样，放入装有225mL灭菌生理盐水的锥形瓶内，振摇均匀。
（3）稀奶油、奶油 用无菌操作打开包装，取适量检样置于灭菌锥形瓶内，在45℃水浴或温箱中加温，溶解后立即将烧瓶取出，用灭菌吸管吸取25mL检样，放入另一225mL灭菌生理盐水或灭菌稀奶油、奶油稀释液的烧瓶内，振摇均匀，从检样溶化到接种完毕的时间不应超过30min。
（4）乳粉 灌装乳粉的开罐取样方法同炼乳处理，袋装乳粉应用75%酒精棉球涂擦消毒袋口，以无菌操作开封取样，称取检样25g，放入装有适量玻璃珠的灭菌锥形瓶内，以225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入（先用少量生理盐水将乳粉调成糊状，再全部加入，以免乳粉结块），振摇使充分溶解和混匀。
（5）干酪 先用灭菌刀削去部分表面封腊，然后用点燃的酒精棉球消毒表面后，用灭菌刀切开干酪，再用无菌手续切取表层和深层的检样各少许，称取25g置于含225mL灭菌生理盐水的均质器内打碎。
2.肉与肉制品检样的处理
（1）生肉及脏器检样的处理 先将检样进行表面消毒（沸水内烫3～5s，或灼烧消毒），再用无菌剪刀剪取检样深层肌肉25g，放入灭菌乳钵内用灭菌剪子剪碎后，加灭菌海砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入灭菌水225mL，混匀，即为1∶10稀释液。
（2）鲜、冻家禽检样的处理 先将检样进行表面消毒，用灭菌剪或刀去皮，剪取肌肉25g（一般可从胸部或腿部剪取），放入灭菌乳钵内用灭菌剪子剪碎后，加灭菌海砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入灭菌水225mL，混匀，即为1∶10稀释液。
（3）各类熟肉制品检样的处理 直接剪取或称取25g，放入灭菌乳钵内用灭菌剪子剪碎后，加灭菌海砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入灭菌水225mL，混匀，即为1∶10稀释液。
样品的采集、送检和检样的处理均以检验肉禽及其制品内的细菌含量来判断其质量鲜度为目的。如需检验肉禽及其制品受外界污染的程度或检索其是否带有某种致病菌，应用棉拭采样法。
食品微生物检测主要是检测食品样品，此外，还要检测食品生产工具。
九、食品生产工具样品的采集与处理
1.食品生产工具的微生物检验
在食品的生产过程中，食品的原料都是含菌的，经过清洗、紫外线照射、蒸煮、烘烤、超高温杀菌等杀菌工艺后，微生物含量急剧下降达到商业无菌状态或无菌状态。但是，这些经过杀菌的食品在冷却、输送、灌装、封口、包装过程中，往往会被接触的物品污染，造成二次污染。因此，为了保证产品的无菌状态，一定要保持生产空间的空气清洁和生产人员的卫生外，同时还要保持与食品直接接触的各种机械设备的清洁卫生和无菌，以防止和减少成品二次污染。
2.食品生产工具样品的采集与处理方法
（1）表面擦拭法 设备表面的微生物检验常用表面擦拭法进行取样，一般是用刷子擦洗法或海绵擦拭法。
①刷子擦洗法：用无菌刷子在无菌溶液中蘸湿，反复刷洗设备表面200～400cm2的面积，然后把刷子放入盛有225mL无菌生理盐水的容器中充分洗涤，将此含菌液进行微生物检验。
②海绵擦拭法：用无菌镊子或戴无菌橡胶手套取体积为4cm×4cm×4cm的海绵或无菌脱脂棉球，浸蘸无菌生理盐水，反复擦洗设备表面100～200cm2，然后将带菌海绵或脱脂棉球放入225mL无菌生理盐水中，进行充分洗涤，将此含菌液进行微生物检验。
（2）冲洗法 一般容器和设备可用一定量无菌生理盐水反复冲洗与食品接触的表面，然后用倾注法检查此冲洗液中的活菌总数，必要时进行大肠杆菌或致病菌项目的检验。
对于较大型设备，可以用循环水通过设备，采集定量的冲洗水，用滤膜法进行微生物检测。
（3）结果报告 一般情况下，设备卫生的微生物检验只进行菌落总数的测定，报告设备表面每平方厘米的含菌量。特殊情况下，需再进行大肠杆菌检测、致病菌或特殊目标菌检验。
知识拓展
国际上常见的采样方案
目前国内外使用的采样方案多种多样，如一批产品采若干个样后混合在一起检验，按百分比抽样；按食品的危害程度不同抽样；按数理统计的方法决定抽样个数等。不管采取何种方案，对抽样代表性的要求是一致的。最好对整批产品的单位包装进行编号，实行随机抽样。下面介绍世界上较为常见的几种采样方案。
（一）美国FDA采样方案
美国食品与药物管理局（FDA）的采样方案与ICMSF的采样方案基本一致，所不同的是严重指标菌所取的15、30、60个样可以分别混合，混合的样品量最大不超过375g。也就是说所取得样品每个为100g，从中取出25g，然后将15个25g混合成375g样品，混匀后再取25g作为试验样品检验，剩余样品妥善保存备查。各类食品检验时的混合样品的最低数量如下：
（二）联合国粮农组织（FAO）规定的采样方案
1979年版FAO食品与营养报告中的食品质量控制手册的微生物学分析中列举了各种食品的微生物限量标准，由于是按ICMSF的采样方案判定的，所以在此引用，见表4-2。
表4-2 各类食品微生物限量标准
续表
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