微生物菌种保藏技术优化方案

一、基本原理

菌种保藏是微生物学的一项重要基础工作，其目的是为了保持微生物的各种优良特征及活动，使其存活，不丢失，不污染，不变异，不退化，不混乱，便于使用，便于交换。为此，可根据微生物自身的生理特点，通过人为地创造一个低温、干燥、缺氧、避光和缺少营养的环境条件，以使微生物的生长受到抑制，新陈代谢作用限制在最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，从而达到保藏的目的。

二、菌种保藏方法

菌种保藏方法很多，有斜面划线或半固体穿刺菌种的普通冰箱低温保藏法、矿物油封藏法、载体保藏法、真空干燥保藏法、冷冻真空干燥保藏法、超低温保藏法和活体寄生保藏法等。

1.传统保藏方法

经常使用的菌种通常用固体斜面划线低温保藏法、半固体穿刺低温保藏法。可保藏3～6个月。如需保藏更长时间，可采用液体石蜡油封藏法、沙土管保藏法、甘油保藏法等。由于这些保藏方法不需要特殊的技术和设备，操作简便易行，故为一般实验室及生产单位所广泛采用。液体石蜡封藏法是在新鲜的斜面培养物上，覆盖一层经过灭菌的液体石蜡，再置于4～5℃冰箱中保藏。液体石蜡主要起隔绝空气作用，故此法是利用缺氧及低温双重抑制微生物生长，从而延长保藏时间。沙土管保藏法是将待保藏菌种接种于斜面培养基上，经培养后制成孢子悬液，将孢子悬液滴入已灭菌的沙土管中，孢子即吸附在沙子上，将沙土管置于真空干燥器中，吸干沙土管中水分，经密封后置于4℃冰箱中保藏。此法是利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。沙土在此保藏法中起载体的作用，为载体保藏法之一，载体还可使用玻璃珠、滤纸片等替代。载体保藏法适用于耐干燥的芽孢杆菌和真菌孢子的保藏。甘油保藏法是在液体的新鲜培养物中加入适量的经过灭菌的甘油，然后再置于-20℃或-70℃冰箱中保藏。此法是利用甘油作为保护剂，甘油透入细胞后，能强烈降低细胞的脱水作用，同时在低温条件下，可大大降低细胞代谢水平，达到延长保藏时间的目的。

2.超低温保藏法

如果实验条件允许，可采用超低温保藏法，即使用超低温冰箱保藏法和液氮超低温保藏法。将微生物细胞直接或离心浓缩后悬浮于液体培养基中或含保护剂的液体培养基中，或者把带菌琼脂块直接浸没于含保护剂的液体培养基中，直接放入-80℃超低温冰箱保藏，或经缓慢冷冻后，再转移至液氮冰箱内，于液相（-196℃）或气相（-156℃）进行保藏。

3.真空干燥保藏方法

如果要更高效长时间保藏微生物菌种，可采用冷冻真空干燥保藏法。冷冻真空干燥保藏法是在低温下，快速将细胞冻起来然后置安瓿管中抽取空气，而使微生物的生长和一切酶的作用暂时停止。为防止因深冻和水分不断升华对细胞的损害，采用保护剂来制备细胞悬液，使其在冻结和脱水过程中，保护性溶质通过氢键和离子键对水和细胞产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。此法综合利用了各种有利于菌种保藏的因素（低温、干燥和缺氧等），是目前最有效的菌种保藏方法之一，广泛适用于细菌（有芽孢或无芽孢的）、放线菌、酵母、产孢子霉菌以及病毒。其保藏期可达一年至十几年，且存活率高、变异率低；不足之处是所需设备昂贵，操作复杂。

总之，不同的菌种和不同的实验条件可选择采用不同的保藏方法。无论采用哪种菌种保藏法，在进行菌种保藏之前都必须设法保证它是典型的纯培养物，在培养的过程中要进行日常的管理和检查，如发现问题应及时处理。

三、菌种保藏操作技术

1.材料

（1）菌种 待保藏的细菌、酵母菌和霉菌。

（2）培养基 营养琼脂斜面和半固体直立柱（培养细菌），麦芽汁琼脂和半固体直立柱（培养酵母菌），高氏1号琼脂斜面（培养放线菌），马铃薯蔗糖斜面培养基（用蔗糖代替葡萄糖有利于孢子形成及用于培养丝状真菌），LB液体培养基。

（3）器皿 试管、接种环、接种针、无菌滴管、带螺口盖和密封圈的无菌试管或1.5mL无菌Eppendorf管、100mL的三角瓶等。

（4）试剂 无菌液体石蜡、沙土、甘油。

2.保藏方法与步骤

（1）斜面低温保藏法（适用于细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的保藏）

①贴标签：将注有菌株名称和日期的标签贴于试管斜面的正下方。

②接种：将待保藏的菌种用斜面接种法移接至注明菌名的试管斜面上。

③培养：细菌置37℃恒温箱中培养18～24h，酵母菌置28～30℃恒温箱中培养36～60h，放线菌和丝状真菌置28℃下培养4～7天。须用健壮的细胞或孢子作为保藏菌种，例如细菌和酵母菌应采用对数生长期后期的细胞，不宜用稳定期后期的细胞（因该期细胞已趋向衰老），对放线菌和丝状真菌则宜采用成熟的孢子。

④收藏：为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉塞外应用牛皮纸包扎，或用熔化的固体石蜡熔封棉塞后置4～5℃冰箱保存。保存温度不宜太低，否则斜面培养基因结冰脱水而加速菌种的死亡。

（2）固体穿刺保藏法（适用于兼性厌氧细菌或酵母菌的保藏）

①贴标签：将注有菌株名称和接种日期的标签贴在半固体直立柱试管上。

②穿刺接种：用穿刺接种法将菌种直刺入直立柱中央，注意不要穿透底部。

③培养：与斜面低温保藏法相同。

④收藏：待菌种生长好后，用浸有石蜡的无菌软木塞或橡皮塞代替棉花塞并塞紧，置4～5℃冰箱中保藏，一般可保藏半年至一年。

（3）液体石蜡保藏法（适用于真菌和放线菌的保藏）

①无菌液体石蜡制备：将液体石蜡置于100mL的三角瓶内，每瓶装10mL，塞上棉塞，外包牛皮纸，高压蒸汽灭菌（0.1MPa30min）。灭菌后将装有液体石蜡的三角瓶置于105～110℃的烘箱内约1h，以除去液体石蜡中的水分。

②接种、培养及保藏：将菌种接种在适宜的斜面培养基上，在适宜温度下培养，使其充分生长。用无菌吸管吸取无菌液体石蜡，注入到已长好菌的斜面上，液体石蜡的用量以高出斜面顶端1cm左右为准，使菌种与空气隔绝，直立于4～5℃冰箱或室温下保藏，保藏期为1～2年。到保藏期后，将菌种转接至新的斜面培养基上，培养后加入适量灭菌液体石蜡，再行保藏。(www.xing528.com)

（4）沙土管保藏法（适用于产孢子的芽孢杆菌、梭菌、放线菌和霉菌的保藏）

①无菌沙土管制备：取河沙若干，用40目筛子过筛，除去大的颗粒。再用10% HCl溶液浸泡（用量以浸没砂面为度）2“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。4h（或煮沸30min），除去有机杂质，倒出盐酸，用自来水冲洗至中性，烘干。另取非耕作层黄瘦土若干，磨细，用100目筛子过筛。取1份制备的土加4份沙混合均匀，装入小试管中（如血清管大小）。装量约1cm高即可，塞上棉塞，0.1MPa灭菌1h，每天一次，连灭3d。

②制备菌悬液：吸取3～5mL无菌水至1支已培养好的菌种斜面中，用接种环轻轻搅动培养物，使成菌悬液。

③加样及干燥：用无菌吸管吸取菌悬液，在每支沙土管中滴加4～5滴菌悬液，塞上棉塞，振荡混匀。将已滴加菌悬液的沙土管置于预先放有五氧化二磷或无水氯化钙的干燥器内。当五氧化二磷或无水氯化钙因吸水变成糊状时则应进行更换。如此数次，沙土管即可干燥。也可用真空泵连续抽气约3h，即可达到干燥效果。

④抽样检查：从抽干的沙土管中，每10支抽取1支进行检查。用接种环取少许沙土，接种到适合于所保藏菌种生长的斜面上，进行培养，观察所保藏菌种的生长及有无杂菌生长情况。

⑤保藏：检查合格后，可采用以下方法进行保藏：a.沙土管继续放入干燥器中，置于室温或冰箱中。b.将沙土管带塞一端浸入熔化的石蜡中，密封管口。c.在煤气灯上，将沙土管的棉塞下端的玻璃烧熔，封住管口，再置4℃冰箱中保藏。此法可保藏菌种1年到数年。

（5）甘油保藏法（适用于细菌保藏）

①无菌甘油制备：将甘油置于100mL的三角瓶内，每瓶装10mL，塞上棉塞，外包牛皮纸，高压蒸汽灭菌（0.1MPa20min）。

②接种、培养及保藏：挑取一环菌种接入LB液体培养基试管中，37℃振荡培养至充分生长。用吸管吸取0.85mL培养液，置入一支带有螺口盖和空气密封圈的试管中或一支1.5mL的Eppendorf管中，再加入0.15mL无菌甘油，封口，振荡混匀。然后将其置于乙醇-干冰或液氮中速冻。最后将已冰冻含甘油的培养物置-20～-70℃保藏，保藏期为0.5～1年。到期后，用接种环从冻结的表面刮取培养物，接种至LB斜面上，37℃培养48h。然后用接种环从斜面上挑取一环长好的培养物，置入装有2mLLB培养液的试管中，再加入2mL含30%无菌甘油的LB液体培养基，振荡混匀。最后分装于带有螺口盖和密封圈的无菌试管中或1.5mL的Eppendorf管中，按上述方法速冻保藏。

3.保藏结果

到期检查菌种保藏结果。

4.注意事项

（1）每种保藏法都有其适宜保藏范围，要根据被保藏菌种的特性选择适宜的保藏方法。如有的微生物不耐冷，可采用真空干燥保藏法而不选择冷冻真空干燥保藏法；有的不耐干燥，则最好不选择载体保藏法如沙土管保藏法。

（2）珍贵菌种需同时由多人保藏，可以相互弥补，以免菌种丢失。

工作任务实施

1.完成实验准备工作

（1）药品和试剂的准备

（2）实验设备的准备

（3）实验用具的准备

2.对培养得到的菌落特征进行观察及描述

对进行菌落总数测定实验得到的菌落进行特征观察，并填写下表。

3.选取一种菌落进行转种分离，并斜面保藏

（1）转种前的准备工作 接种前将空白斜面贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名。标签应贴在斜面向上的部位。开启超净工作台30min后待用。

（2）采用平板划线分离法进行转种 点燃酒精灯，在火焰旁进行如下操作：用接种环以无菌操作蘸取少许待分离的液体样品（固体样品需用无菌生理盐水稀释后取样），在无菌平板表面进行平行划线、连续划线、交叉划线、扇形划线、方格划线或其他形式的划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落，见图3-21。

图3-21 平板划线分离法

（3）采用斜面划线法进行斜面保藏 点燃酒精灯，右手持接种环，让接种环直立在火焰中金属环烧红灭菌，再将接种环来回通过火焰数次，使环以上凡在接种时可能进入试管的部分都用火焰灼烧灭菌。右手小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧（棉塞下部应露在手外，切勿放在桌上，以免污染），试管口迅速在火焰上微烧一周，使试管口上可能沾染的少量杂菌或带菌尘埃得以灭菌。将灭菌后的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分使其冷却，以免烫死菌体；再用环轻轻挑取菌体少许，将接种环慢慢从试管中抽出，在火焰旁迅速伸进另一空白斜面试管内，在斜面培养基上轻轻划线接种菌体，见图3-13和图3-14。注意，划线时应从底部划起，划成较密的波浪线；或由底部向上划一条直线，一直划到斜面的顶部。最后灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上。

（4）注意事项

①接种操作时要使试管口或培养皿靠近火焰旁上方区域（即在无菌区内）。

②在固体培养基上划线时注意勿将培养基划破，也不要使菌体沾污管壁或其他地方。

（5）实验后整理