如何进行细菌接种与分离？

一、基本原理

自然界微生物是以混杂的状态存在的。分离和纯化的目的是从各种样品来源混杂的微生物群体中获得纯种微生物，即在一定的条件下培养、繁殖得到只有一种微生物的培养物也称为纯培养物。分离纯化微生物的方法有很多种，但基本原理相似，一般是将待分离的样品进行一系列的稀释，使稀释样品中的微生物或孢子呈分散状态，然后在适宜的培养基和培养条件下长出单菌落，再将单菌落转移培养。重复此过程两、三次便可获得纯种微生物。

常用的分离纯化的方法有稀释倒平板法、平板划线分离法、涂布平板法、亨盖特稀释滚管法、单细胞（单孢子）挑取法、利用选择培养基进行分离等。大多数好氧且数量大的微生物可采用稀释倒平板法和平板划线分离法进行分离，热敏菌和严格好氧菌可采用涂布平板法，而严格厌氧菌则需采用稀释滚管法，对于比较大而个体数少的单细胞和单孢子可采用单细胞（单孢子）挑取法，对于那些生长慢、营养要求或生长条件特殊的微生物则需利用选择培养基结合其他方法进行分离。

二、接种

微生物的接种是将一种微生物移接到另一灭过菌的新培养基中，使其生长繁殖的过程。接种方法有斜面接种、液体接种、平板接种、穿刺接种等。无论是从斜面到斜面或到液体或到平板或相反的过程，接种的核心问题在于接种过程中，必须采用严格的无菌操作，以确保纯种不被杂菌污染。

1.常用接种方法

（1）划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的目的，如图3-10所示。

常用的接种工具有接种环、接种针等，如图3-11所示。在斜面接种和平板划线中就常用此法。

（2）三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它们各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。

（3）穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针，用的培养基一般是半固体培养基。做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。

图3-10 划线接种操作图

图3-11 接种和分离工具

1—接种针 2—接种环 3—接种钩 4、5—玻璃涂布棒 6—接种圈 7—接种锄 8—小解剖刀

（4）混合接种 该法是将待接种的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45℃左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到了稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。

（5）涂布接种 与混合接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。

（6）液体接种 从固体培养基中将菌体洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。

2.无菌操作

培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程称作无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。接种时打开培养皿的时间应尽量短，用于接种的器具必须经过干热或火焰等灭菌。

以斜面接种为例展示无菌操作的流程，如图3-12所示。通常接种环在火焰上充分烧红，即手持接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次；冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上；然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，注意不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。

平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。

图3-12 斜面接种时的无菌操作

对于实验台面，不论是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒剂擦洗，水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。在实验台上方，空气流动应缓慢，杂菌应尽量减少，其周围杂菌也应越少越好。为此，必须清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。

三、分离纯化

含有一种以上的微生物培养物称为混合培养物。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化。

1.倾注平板法(www.xing528.com)

首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40～50℃的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒温箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物，如图3-13所示。

图3-13 倾注平板法

1—菌悬液 2—熔化的培养基 3—培养物 4—无菌水

2.涂布平板法

倾注平板法可能会影响热敏菌和严格好氧菌的生长而使这些菌无法很好分离出，此种情况可采用涂布平板法。其操作方法是：先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量（0.1mL或0.2mL）的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂布棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落，如图3-14所示。重复此过程数次，即可分纯菌种。

3.平板划线法

最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线，当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。

图3-14 平板涂布法示意图

划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等，如图3-15所示。

图3-15 平板划线分离法

1—斜线法 2—曲线法 3—方格法 4—放射法 5—四格法

4.富集培养法

富集培养法的方法和原理非常简单。我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌体很容易在固体培养基上长出单菌落。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。

5.厌氧培养法

在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，利用N₂或CO₂取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。

四、转种技术

当进行菌体的分离培养后，需要将分离出的单菌落接种到新鲜的培养基上继续培养，以便进行后续的实验，例如菌株鉴定、大量菌体的获得等，将这种将培养物继续接种的操作手法称为转种。

将菌体转种到斜面和斜面接种的操作步骤基本一致，但操作手法略有不同。斜面转种的操作手法如图3-16所示，将菌种管和新鲜空白斜面试管的斜面向上，用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间的部位，无名指和大拇指分别夹住两试管的边缘，管口齐平，试管横放，管口稍稍上斜。

图3-16 斜面接种时试管的两种拿法

转种过程：操作前可先将斜面试管的棉塞旋转松动，以方便接种时拔出。点燃酒精灯，右手持接种环，让接种环直立在火焰中金属环烧红灭菌，再将接种环来回通过火焰数次，使环以上凡在接种时可能进入试管的部分都用火焰灼烧灭菌。右手小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧（棉塞下部应露在手外，切勿放在桌上，以免污染），试管口迅速在火焰上微烧一周，使试管口上可能沾染的少量杂菌或带菌尘埃得以灭菌。将灭菌后的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分使其冷却，以免烫死菌体；再用环轻轻挑取菌体少许，将接种环慢慢从试管中抽出，在火焰旁迅速伸进另一空白斜面试管内，在斜面培养基上轻轻划线接种菌体，如图3-17所示。注意，划线时应从底部划起，划成较密的波浪线；或由底部向上划一条直线，一直划到斜面的顶部。最后灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上。

图3-17 斜面转种无菌操作

如果进行穿刺转种，则只需将接种环改为接种针，用接种针自培养基中心垂直刺入培养基中直到接近试管底部，然后沿着接种线将针拔出，最后塞上棉塞即可，见图3-18。接种完毕，将接种环上的残留菌体在火焰上彻底灭菌。

图3-18 穿刺接种