消毒与灭菌技术在食品生产中的应用

一、相关概念

利用环境对微生物影响，能够采用相应的手段和措施对微生物进行控制、抑制甚至杀灭，但控制的程度不同，对微生物产生的效果就不同。

（1）消毒 采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌，而对被消毒的对象基本无害的措施。

（2）灭菌 采用强烈的理化因素使物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。食品生产中常把消毒和灭菌统称为杀菌。

（3）防腐 一种利用理化因素完全抑制微生物生长，防止物品霉腐的方法，这是一种抑菌作用。

（4）除菌 一种利用机械的方法除去液体或气体中微生物的方法，例如过滤、离心分离、静电吸附等。

二、杀菌技术

常用的杀菌技术可以分为四大类：①温度灭菌；②过滤除菌；③辐照灭菌；④化学药剂灭菌。

1.温度灭菌

不同种类的微生物生长的温度范围不同，根据生长与温度的关系，微生物的生长有三个温度基点：即最适、最高、最低。根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物分为：低温微生物、中温微生物和高温微生物。

（1）低温灭菌 嗜温微生物是普遍存在的微生物，一般引起食品腐败变质的微生物大部分属于此群。嗜温微生物处于低温环境下，其代谢被抑制，生长速度变缓，但仍可保持存活状态。因此在实际的食品保藏中，常采用低温对食品中的微生物进行控制，采用0℃左右或略高一点的温度来冷藏，抑制微生物的生长和繁殖，使食物得以贮藏。

（2）高温灭菌 高温灭菌是通过高温作用于微生物细胞，引起细胞内原生质体凝固、酶结构被完全破坏，使细胞生化反应停止、新陈代谢终止，最终导致细胞死亡，从而达到灭菌效果的一种灭菌方式。

①干热灭菌：干热灭菌是一种利用火焰或热空气杀死微生物的方法，简单易行，但使用范围有限。

a.灼烧法：直接使用火焰进行灼烧灭菌，是最简单、最彻底的一种灭菌方式，常用于接种工具、污染物品、实验动物尸体等的灭菌。

b.干燥热空气灭菌法：利用电热烘箱作为干热灭菌器，一般加热至160～170℃维持1.5～2h即可达到灭菌目的。常用于玻璃器皿、金属用具等的灭菌。凡带有胶皮的物品、液体及固体培养基等不能用干热灭菌。

②湿热灭菌：湿热灭菌是利用煮沸或饱和热蒸汽杀死微生物的一种方法。在同样温度和相同作用时间下，湿热灭菌要比干热灭菌的效果好，其原因在于：热蒸汽穿透力强；细胞物质在含水量高时容易变性凝固；蒸汽凝固时释放的大量蒸汽潜热可迅速提高灭菌物品的温度。湿热灭菌被广泛用于培养基和发酵设备的灭菌。

a.高压蒸汽灭菌法：利用高压灭菌器，使水的沸点在密封的灭菌器内随着压力升高来提高蒸汽的温度和灭菌的效率。该方法应用广泛，培养基和器皿均可采用此法灭菌处理。

高压灭菌器的主要构成部分是：灭菌锅、盖、压力表、放气阀、安全阀等。高压蒸汽灭菌操作过程如下：

加水：在灭菌器内加入一定量的水。水不能过少，以免将灭菌锅烧干引起爆炸事故。

装料：将待灭菌的物品放在灭菌锅搁架内，不要过满，包扎物之间要留有适当的空隙以利于蒸汽的流通。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞。

加盖：将盖上与排气孔相连接的排气管插入内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开排气阀。

加热排气：加热至水沸腾后，水蒸气和空气一起从排气孔排出。一般认为，当排气孔的气流很强并有嘘声时，表明锅内冷空气已排净（沸后约5min）。

升压：当锅内空气已排尽时，即可关闭排气阀，压力开始上升。

灭菌：当锅内压力逐渐上升至所需压力时，维持所需时间。一般实验采用压力0.1MPa，温度121℃，20min灭菌。或根据灭菌要求的温度和时间进行灭菌。

降压：达到灭菌所需时间后，让压力自然下降到零，再打开排气阀，放净余下的蒸汽。打开锅盖，取出灭菌物品。如果压力未完全下降至零时，切勿打开锅盖，否则锅内压力骤然降低，会造成培养基剧烈沸腾而冲出管口或瓶口，污染棉塞，导致污染。

保养：灭菌完毕取出物品后，需清理高压灭菌锅内剩水，保持内壁及搁架干燥，盖好锅盖。

b.煮沸法：在100℃下煮沸数分钟的方法，常用于饮用水的消毒。

c.间歇灭菌法：适用于不耐高温的营养物质的培养基或无高压蒸汽灭菌锅时处理一般培养基的灭菌，其原理为：常压蒸汽（100℃）处理杀死营养细胞，残留的芽孢等耐热的孢子体经过夜培养即可萌发，再加热处理杀死之，如此反复处理三次，可达到无菌状态。方法是在95～98℃蒸煮15～60min，冷却至37℃培养过夜，连续重复三天，可控制芽孢杆菌芽孢制剂。

d.巴氏灭菌法：是一种专用于牛乳、啤酒、果酒或酱油等不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料的低温消毒方法。

2.过滤除菌

过滤除菌法系采用特殊的细菌过滤器来进行，例如硝化纤维素滤膜。一些受热易分解物质如抗生素、血清、维生素等要采取过滤除菌法。病毒等小于0.2mm的非细胞微生物无法去除。

3.辐照灭菌

辐照灭菌是采用微波、紫外线、γ-射线、X-射线对不耐热或受热易变质、变味的物品进行杀菌。其中γ-射线的穿透力非常强，可对密封包装后的物品进行灭菌。实验室常用的辐照灭菌一般是紫外线灭菌，其穿透力弱，常常用于空气消毒或物体表面灭菌处理。(www.xing528.com)

4.化学药剂灭菌

使用能杀死微生物或能抑制微生物生命活动的化学制剂进行杀菌。理想的化学药剂应该为杀菌力强，使用方便，价格低廉，对人畜无害，无味无嗅。

三、灭菌前的准备

1.物品的包扎

（1）培养皿的包扎 培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。

（2）移液管的包扎 在移液管的上端塞入一小段棉花（勿用脱脂棉），它的作用是避免外界及口中杂菌进入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm，棉花自身长度约1～1.5cm。塞棉花时，可用一外围拉直的曲别针、将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。

包扎手法如图3-6所示，先将报纸裁成宽约5cm的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45°角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。

图3-6 移液管的包扎

2.培养基的分装

根据不同需要，可将已配好的培养基分装入试管或三角瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。

（1）试管的分装 取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹住玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内，如图3-7所示。

图3-7 试管的分装

装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15mm×150mm时，液体培养基可分装至试管高度1/4左右为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全熔化后，应趁热分装于试管中。用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1/5（约3～4mL），半固体培养基分装量为管高的1/3为宜。

（2）三角瓶的分装 用于振荡培养微生物时，可在250mL三角瓶中加入50mL的液体培养基；若用于制作平板培养基用时，可在250mL三角瓶中加入150mL培养基，然后再加入3g琼脂粉（按2%计算），灭菌时瓶中琼脂粉可同时被熔化。

3.棉塞的制作

为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或三角瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及三角瓶口加上棉花塞等。

（1）试管棉塞的制作 制作棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的团孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞，然后直接压入试管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞，如图3-8所示。

图3-8 棉塞的制作

制作好的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2/3在试管内，1/3在试管外，如图3-9所示。目前也有采用硅胶塞代替棉塞直接盖在试管口上。

将装好培养基并塞好棉塞或硅胶塞的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。用记号笔注明培养基名称及配制日期，灭菌待用。

4.三角瓶棉塞制作

通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅胶塞直接盖在瓶口上。

图3-9 正确与不正确的棉塞

1—金属塞 2—正确 3、4—不正确

在装好培养基并塞好棉塞或包扎8层纱布或盖好硅胶塞的三角瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线绳捆好，灭菌待用。

四、高压蒸汽灭菌锅的使用

1.高压蒸汽灭菌原理

高压蒸汽灭菌器的装置严密，产生蒸汽不外逸，温度随蒸汽压力增高而增高。高压蒸汽灭菌就是利用高压和高热对微生物的杀灭作用进行灭菌的。

高压蒸汽灭菌是目前可靠而有效的灭菌方法，适用于耐高温、高压、不怕潮湿的物品，如稀释液、培养基等。要达到高压蒸汽灭菌效果，很重要的一点就是使冷空气从灭菌器中顺利排出，这是因为冷空气导热性差，阻碍蒸汽接触欲灭菌物品，并且还可能减低蒸汽压力使之不能达到应有的温度。

2.高压蒸汽灭菌器的使用方法

一般高压灭菌器为金属圆筒形，分为内外两层，隔层中盛水，有盖，可以旋紧。加热隔层中的水后自动产生蒸汽。灭菌器外部装有压力和温度显示器，当压力升高时温度也随之升高。

自动高压灭菌器的操作方法如下：在隔层中按要求盛一定量水，将待灭菌的物品随同盛装的桶放入灭菌器内；将盖子盖好，旋紧。开动电源，调整灭菌温度和时间，确定。灭菌锅自动进行排出冷空气和加热保温的处理。灭菌后不能马上打开盖子，需待灭菌器内高压释放完毕，压力表指针为“0”时，缓慢打开盖子取出物品。