如何制备不同种类的微生物培养基？

培养基是用人工方法将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质配制而成的营养基质，其主要成分必须包括微生物生长所需的6大营养要素，即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子，且其间的比例是适合的。

培养不同种类的微生物，所需的培养基不同；同一种类的微生物由于培养目的不同，所需的培养基也有差别。

一、培养基的分类

由于微生物的营养类型复杂，各种微生物需要的营养物质不同，所以，培养基的种类也很多，根据其成分、物理状态和用途可将培养基分为多种类型。

1.按成分不同划分

（1）天然培养基 这类培养基含有化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物，也称非化学限定培养基。牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基就属于此类。

常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏（表3-7）、豆芽汁、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛乳、血清、稻草浸汁、胡萝卜汁、椰子汁等，嗜粪微生物可以利用粪水作为营养物质。天然培养基成本较低，除在检验室经常使用外，也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。

表3-7 牛肉浸膏、蛋白胨及酵母浸膏的来源及主要成分

（2）合成培养基 合成培养基是由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基，也称化学限定培养基，高氏Ⅰ号培养基和查氏培养基就属于此种类型。合成培养基重复性强，但与天然培养基相比，其成本较高，且微生物在其中生长速度较慢，一般适于在实验室中用来进行有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的科学研究工作。

2.根据物理状态划分

根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少，可将培养基划分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种类型。

（1）固体培养基 在实验室中，固体培养基一般是加入平皿或试管中，制成培养微生物的平板或斜面。固体培养基为微生物提供一个营养表面，单个微生物细胞在这个营养表面进行生长繁殖，可以形成单个菌落。固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。固体培养就是在液体培养基中加入一定量的琼脂等作为凝固剂，使其成为固体状态即为固体培养基，通常琼脂加入量为1.5%左右。

理想的凝固剂应具备以下条件：

①本身不被培养的微生物分解利用；

②在微生物生长的温度范围内保持固体状态，在培养嗜热细菌时，由于高温容易引起培养基液化，通常在培养基中适当增加凝固剂来解决这一问题；

③凝固剂凝固点温度不能太低，否则将不利于微生物的生长；

④凝固剂对所培养的微生物无毒害作用；

⑤凝固剂在灭菌过程中不会被破坏；

⑥透明度好，黏着力强；

⑦配制方便且价格低廉。常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶（表3-8）。

表3-8 琼脂与明胶主要特征比较

对绝大多数微生物而言，琼脂是最理想的凝固剂。琼脂是由藻类（海产石花菜）中提取的一种高度分支的复杂多糖。明胶是由胶原蛋白制备得到的产物，是最早用来作为凝固剂的物质，但由于其凝固点太低，而且某些细菌和许多真菌产生的非特异性胞外蛋白酶以及梭菌产生的特异性胶原酶都能液化明胶，目前已较少被作为凝固剂使用。硅胶是由硅酸钠或硅酸钾被盐酸或硫酸中和时凝聚而成的胶体，它不含有机物，适合配制用于培养和分离自养型微生物的培养基。

除在液体培养基中加入凝固剂制备的固体培养基外，一些由天然固体基质制成的培养基也属于固体培养基，例如由马铃薯块、胡萝卜条、小米、麸皮及米糠等制成固体状态的培养基就属于此类，又如生产酒的酒曲，生产食用菌的棉子壳培养基。

（2）半固体培养基 半固体培养基中凝固剂的含量比固体培养基少，培养基中琼脂含量一般为0.2%～0.7%，半固体培养基常用来观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定等。

（3）液体培养基 液体培养基中未加任何凝固剂。在用液体培养基培养微生物时，通过振荡或搅拌可以增加培养基的通气量，同时使营养物质分布均匀。液体培养基常用于大规模工业生产，以及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究。

3.按用途划分

（1）基础培养基 尽管不同微生物的营养需求各不相同，但大多数微生物所需的基本营养物质是相同的。基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。基础培养基也可以作为一些特殊培养基的基础成分，再根据某种微生物的特殊营养需求，在基础培养基中加入所需营养物质。

（2）加富培养基 加富培养基也称营养培养基，即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。

加富培养基一般用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物，如培养百日咳博德特菌就需要含有血液的加富培养基。加富培养基还可以用来富集和分离某种微生物，这是由于加富培养基含有某种微生物所需的特殊营养物质，提高该微生物的生长速度，并逐渐富集而使其成为优势菌，逐步淘汰其他微生物，从而达到分离该种微生物的目的。从某种意义上讲，加富培养基类似选择培养基，但两者区别在于：加富培养基是用来增加所要分离的微生物的数量，使其形成生长优势，从而分离到该种微生物；而选择培养基则一般是抑制不需要的微生物的生长，使所需要的微生物增殖，从而达到分离所需微生物的目的。

（3）鉴别培养基 鉴别培养基是用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可将该种微生物与其他微生物区分开来。鉴别培养基主要用于微生物的快速分类鉴定，以及分离和筛选产生某种代谢产物的微生物菌种。常用的一些鉴别培养基见表3-9。

表3-9 常用鉴别培养基

（4）选择培养基 选择培养基是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。

一种类型的选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计的。例如，利用以纤维素或石蜡油作为唯一碳源的选择培养基，可以从混杂的微生物群体中分离出能分解纤维素或石蜡油的微生物。利用以蛋白质作为唯一氮源的选择培养基，可以分离产胞外蛋白酶的微生物；缺乏氮源的选择培养基可用来分离固氮微生物。(www.xing528.com)

另一类选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物。例如，在培养基中加入数滴10%酚酞可以抑制细菌和霉菌的生长，从而由混杂的微生物群体中分离出放线菌；在培养基中加入亚硫酸铋，可以抑制革兰氏阳性细菌和绝大多数革兰氏阴性细菌的生长，而革兰氏阴性的伤寒沙门菌可以在这种培养基上生长；在培养基中加入染料亮绿或结晶紫，可以抑制革兰氏阳性细菌的生长，从而达到分离革兰氏阴性细菌的目的；在培养基中加入青霉素、四环素或链霉素，可以抑制细菌和放线菌生长，而将酵母菌和霉菌分离出来。现代基因克隆技术中也常用选择培养基，在筛选含有重组质粒的基因工程菌株过程中，利用质粒上具有的对某种（些）抗生素的抗性选择标记，在培养基中加入相应抗生素，就能比较方便地淘汰非重组菌株，以减少筛选目标菌株的工作量。

在实际应用中，有时需要配制既有选择作用又有鉴别作用的培养基。例如，当要分离金黄色葡萄球菌时，在培养基中加入7.5%氯化钠、甘露糖醇和酸碱指示剂，金黄色葡萄球菌可耐高浓度氯化钠，且能利用甘露糖醇产酸。因此，能在上述培养基生长，而且菌落周围培养基颜色发生变化，则该菌落有可能是金黄色葡萄球菌，再通过进一步鉴定加以确定。

二、培养基的配制原则

配制培养基首先要明确培养目的，即明确是进行特定微生物菌种的鉴别实验，还是进行微生物菌种的生物学特性研究，还是要获得大量的微生物菌体，还是要利用微生物生产发酵食品或积累目标代谢产物等。

其次，还需了解要培养的微生物种类，按照不同种类微生物的营养需求，确定对应培养基的配方。常用微生物培养基的配方和配制方法可以参照 GB 4789.28—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》。

如果需要自己调整培养基配方时，可以参照已有配方，同时注意新配方的碳氮比（C/N），此外还要通过试验选择适当的酸碱度（pH），保持适当的缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。

三、培养基的配制流程

在根据培养目的确定培养基配方后，在实验室里一般依据以下流程配制培养基：按配方计算，称量→加水溶解（加琼脂熔化）→过滤澄清→调节pH→分装→加塞，包扎→灭菌→无菌检验→待用。

1.计算和称量

根据所需培养基数量，依据培养基配方，准确计算并称取各种原料成分。

在容器中加所需水量的一半，然后依次将各种原料加入水中，用玻璃棒搅拌使之溶解。如果有某些不易溶解的原料，例如蛋白胨、牛肉膏等，可事先在小容器中加少量水，加热溶解后再冲入到该容器中。如果有些原料需用量很少，不易称量，则可先配制成高浓度的溶液再按比例换算后加入到该容器中。

2.溶解

待原料全部放入容器后，加热使其充分溶解，并补足需要的全部水分，混合均匀，即成液体培养基。在配制固体培养基时，预先将琼脂称量好（粉状琼脂可直接加入，条状琼脂用剪刀剪成小段，以便熔化），然后将液体培养基煮沸，再把琼脂放入，继续加热至琼脂完全熔化。在加热过程中应注意不断搅拌，以防琼脂沉淀在锅底烧焦，并应控制火力，以免培养基因暴沸而溢出容器。待琼脂完全熔化后，再用热水补足因蒸发而损失的水分。

3.调节pH

液体培养基配好后，一般要调至所需的pH。常用一定浓度的盐酸及氢氧化钠溶液进行调节。调节pH可以使用精密pH试纸，也可使用酸度计。

固体培养基pH的调节，与液体培养基相同。一般在加入琼脂后进行。进行调节时，应注意将培养基温度保持在80℃以上，以防因琼脂凝固影响调节操作。

4.分装

培养基配好后，要根据不同的使用目的，分装到试管或三角瓶中。装入试管的培养基视试管大小及需要而定。如液体则分装至试管高度的1/4左右为宜；如固体则分装量为管高的1/5；如系半固体培养基，则分装至试管1/2～1/3的高度为宜。用三角瓶分装培养基时，容量以不超过容积的一半为宜。

5.灭菌

配制好的培养基和微生物实验过程中使用的器具如培养皿、试管、三角瓶和移液管等均需进行灭菌处理。

常用的灭菌（消毒）方法可以分为四大类：①加热灭菌（包括火焰直接灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮沸消毒）；②过滤除菌；③射线灭菌和消毒；④化学药剂灭菌和消毒。培养基的灭菌常使用加热灭菌中高压蒸汽灭菌法（即湿热灭菌）。

6.无菌检查

灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好从中取出1～2管（瓶），置于30～37℃恒温箱中保温培养1～2d，如发现有杂菌生长，应及时再次灭菌，以保证使用前的培养基处于绝对无菌状态。

四、斜面和平板的制备

灭菌后的固体培养基要趁热制作斜面试管和固体平板。

1.斜面的制备

斜面培养基的斜度要适当，斜面的长度不超过试管长度的1/2，如图3-4所示。摆放时注意不可使培养基沾污棉塞，且冷却凝固过程中勿再移动试管。制成的斜面以稍有凝结水析出者为佳。待斜面完全凝固后，再进行收存。制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷却凝固。

2.平板的制备

将已灭菌的固体培养基（装在锥形瓶或试管中）冷却至50℃左右倾入无菌培养皿中。如果倾倒温度过高，则容易在皿盖上的形成太多冷凝水；如果倾倒温度低于45℃，则培养基容易凝固。

倾倒操作时应在超净工作台上酒精灯火焰旁进行，如图3-5所示，右手握住锥形瓶或试管的底部，左手持培养皿的同时，用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶（管）口，用左手大拇指将培养皿盖打开一道缝，宽度为瓶口刚好伸入为宜，倾入培养基约12～15mL（一般在平板培养基中的高度约3mm），静置于台面待凝固后备用。

图3-4 培养基斜面试管的摆放

图3-5 培养基平板的制作