微生物生长的测定方法及生长曲线分析

一、微生物生长的测定

微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收营养物质并进行代谢活动，使其细胞质的量不断增加，体积增大，数量增多，我们认为微生物在进行生长。

1.测定方法

微生物的生长往往是通过繁殖来体现的，本质上是以群体细胞数目的增加为生长标志。因此我们研究和测定微生物的生长多是指群体的生长。

（1）细胞数的测定

①直接计数法。

直接计数法需要细菌计数器或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量，又称为显微计数法。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜进行观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，如图3-1所示。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm²，每个小方格的面积为1/400mm²。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm³，每个小方格的体积为1/4000mm³。

使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量，即：

细胞数（每毫升菌悬液）=每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）

图3-1 血细胞计数板

1—血细胞计数板 2—盖玻片 3—计数室

②平板菌落计数法。

根据细菌能在适宜条件下在固体培养基上生长繁殖形成菌落的特点，取一定量的菌体稀释液，采用平板涂布法或倾注法将其接种在培养基上，提供适宜的培养条件，使一个活细胞形成一个单菌落，对平板上的菌落进行计数，再乘以稀释倍数，从而换算出菌体数量。

平板菌落计数法简单灵活，可以广泛应用于测定多种样品中的细菌、酵母菌等的数量，但不适于测定样品中的丝状体微生物，例如放线菌、丝状真菌等。如果生长的菌落连成片状，没有有效的分开，则会导致计数效果不佳。因此，采用平板菌落计数法，应控制每个平板上的菌落数量在30～300为最佳，过多难以计数，过少则增大计数误差。

（2）细胞生物量的测定

①细胞干重法。

将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来，然后烘干（干燥温度可采用105℃、100℃或80℃）、称重。一般干重为湿重的10%～20%，而一个细菌细胞一般重约10^-13～10^-12g。

举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10^-13～10^-12g，液体培养物中细胞浓度达到2×10⁹个/mL时，100mL培养物可得10～90mg干重的细胞。

②其他方法。

利用微生物细胞中的DNA含量的测定来估算菌体数量，称为DNA含量测定法。还可以根据微生物的生命活动强度即代谢活性来估算其生物量，称为代谢活性法。

2.生长曲线

将少量纯种单细胞微生物接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样测定细胞密度（CFU），以细胞数目的对数值为纵坐标（Y轴），以培养时间为横坐标（X轴），所作出的曲线称为单细胞微生物的典型生长曲线，如图3-2所示。根据微生物的生长速率，可将该曲线分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期。

（1）延滞期 延滞期又称为停滞期、适应期或调整期。当微生物刚接种到培养基上，其需要一段时间对新环境进行适应，在这个时期，一般不进行繁殖，表现为细胞个体变大和代谢活跃。延滞期的长短与菌种的遗传特性、菌龄、接种量及接种前后培养基成分的差异有关。

（2）指数期 经过延滞期的适应后，菌体细胞进入繁殖期，这是其生长速率最大的时期，在曲线上的表现为一条上升的直线。此时期内，菌体细胞代谢旺盛，细胞的增殖率远大于死亡率。

图3-2 单细胞微生物的典型生长曲线

Ⅰ—延滞期 Ⅱ—指数期 Ⅲ—稳定期 Ⅳ—衰亡期

（3）稳定期 在指数期的末期，由于菌体的大量增殖，消耗了培养基中的大量营养物质，导致营养物的比例失衡，使菌体的生长速率降低，增殖率下降而死亡率上升，当二者趋于平衡时，就进入了稳定期。此时，活菌数达到了最大值，并可相对持续一段时间。稳定期的长短与菌种特性和环境条件相关。在工业发酵中，可以通过调整环境条件来延长菌种的稳定期，从而获得更多的菌体或代谢产物。

（4）衰亡期 随着培养基营养和环境条件的进一步恶化，菌种的死亡率也迅速增加，以至于超过增殖率，表现为曲线出现直线下降。这个时期，菌体细胞形态多变，产生许多畸形或退化型，有的微生物还会出现自溶。

3.生长参数

在生产实践中，计算微生物生长过程中的迟缓时间、比生长速率和总生长量这3个主要参数，对指导生长有着重要的实际意义。

（1）迟缓时间 指微生物在生长过程中，实际达到对数生长期所需时间与理想条件下达到对数期所需时间之差。延缓生长量反映了迟缓期给细胞物质的工业化生产造成的损失。

（2）比生长率 表示生长速度与生长基质浓度之间的关系，当营养物质浓度很低时，比生长率与营养物质浓度成正比。因此比生长率与生长基质的浓度密切相关。

（3）总生长量 指通过培养获得的微生物总量与原来接种的微生物量之差值，其大小客观反映了培养基与生长条件是否适合菌体生长。与总生长量相关的另一参数产量常数K则代表了总生长量与消耗基质总量之比，它反映了微生物对基质同化的效率。

二、微生物生长的环境因素

微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物浓度、温度、水分、氧气、pH等。

1.温度(www.xing528.com)

在一定的温度范围内，每种微生物都有自己的生长温度三基点：最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度。在生长温度三基点内，微生物都能生长，但生长速率不一样。微生物只有处于最适生长温度时，生长速度才最快，代时最短。超过最低生长温度，微生物不会生长，温度太低，甚至会死亡。超过最高生长温度，微生物也要停止生长，温度过高也会死亡。一般情况下，每种微生物的生长温度三基点是恒定的，但也常受其他环境条件的影响而发生变化。

根据微生物最适生长温度的不同，可将它们分为三个类型：

（1）嗜冷微生物 其最适生长温度多数在-10～20℃。

（2）中温微生物 其最适生长温度一般在20～45℃。

（3）嗜热微生物 其最适生长温度在45℃以上。

2.水分和渗透压

水分是微生物进行生长的必要条件，微生物是不能脱离水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生长，而不能生活在纯水中。各种微生物在不能生长发育的水分活性范围内，均具有狭小的适当的水分活性区域。

微生物细胞通常具有比环境高的渗透压，利于其从环境中吸收水分。除极端生态条件外，适宜微生物生长的渗透压范围较广。低渗透压能破坏细胞原生质体的稳定性；高渗透压会使细胞原生质脱水，从而抑制微生物的生长。某些能在高渗透压环境中生长的微生物被称为耐高渗微生物。

3.氧气

按照微生物对氧气的需要情况，可将它们分为以下五个类型。这五种类型的微生物在液体培养基中的生长特性如图3-3所示。

（1）需氧微生物 这类微生物需要氧气供呼吸之用。没有氧气，便不能生长，但是高浓度的氧气对需氧微生物也是有毒的。很多需氧微生物不能在氧气浓度大于大气中氧气浓度的条件下生长。绝大多数微生物都属于这个类型。

（2）兼性需氧微生物 这类微生物在有氧气存在或无氧气存在情况下，都能生长，但所进行的代谢途径不同。在无氧气存在的条件下，它进行发酵作用，例如酵母菌的无氧乙醇发酵。

（3）微量需氧微生物 这类菌是需要氧气的，但只在20.3kPa下生长最好。这可能是由于它们含有在强氧化条件下失活的酶，因而只有在低压下作用。

（4）耐氧微生物 这类微生物在生长过程中，不需要氧气，但也不怕氧气存在，不会被氧气所杀死。

（5）厌氧微生物 这类微生物在生长过程中，不需要分子氧。分子氧存在对它们生长产生毒害，使其不能生长甚至死亡。

图3-3 五种对氧需求不同的微生物在液体培养基中的生长特性

4.pH

环境的酸碱度对微生物的生长也有很大影响。一般来说，微生物能在pH1～11的范围内生长，但不同种类的微生物其适应力不同，其适宜pH就不同。细菌为pH6.5～7.5，放线菌为pH7.5～8.0，霉菌和酵母菌为pH4～6。

根据微生物生长的最适pH，将微生物分为以下几类：

（1）嗜碱微生物 硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌。

（2）耐碱微生物 许多链霉菌。

（3）中性微生物 绝大多数细菌，部分真菌。

（4）嗜酸微生物 硫杆菌属。

（5）耐酸微生物 乳酸杆菌、醋酸杆菌。

同一种微生物在不同的生理阶段对pH的要求也不同。例如在发酵工业中，控制pH尤其重要，如黑曲霉在pH2～2.5主要产柠檬酸，而在pH2.5～6.5以菌体生长为主，当pH7时以合成草酸为主。

三、培养方法

一般细菌都可用人工方法进行培养，以进一步研究它们的各种生物学特性。培养细菌时，根据研究目的和细菌生长条件的差异，需采用不同的接种技术和培养方法。

根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养两大类。

1.好氧培养

好氧培养也称好气培养。就是说这种微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就不能生长良好。在实验室中，斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中。

2.厌氧培养

厌氧培养也称厌气培养。这类微生物在培养时，不需要氧气参加。在厌氧微生物的培养过程中，最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。一般可采用下列几种方法：

（1）降低培养基中的氧化还原电位 常将还原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等，加入到培养基中，便可达到目的。有的将一些动物死的或活的组织如牛心、羊脑加入到培养基中，也可适合厌氧菌的生长。

（2）化合去氧 这也有很多方法，主要有：用焦性没食子酸吸收氧气；用磷吸收氧气；用好氧菌与厌氧混合培养吸收氧气；用植物组织如发芽的种子吸收氧气；用产生氢气与氧化合的方法除氧。

（3）隔绝阻氧 深层液体培养；用石蜡油封存；半固体穿刺培养。

（4）替代驱氧 用二氧化碳驱代氧气；用氮气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧气；用混合气体驱代氧气。