制作真菌标本片的项目三

一、酵母菌标本片的制作

1.基本原理

酵母菌是以出芽繁殖为主要特征的、不运动的单细胞真核微生物。其细胞核与细胞质有明显分化，个体大小比常见细菌大几倍甚至十几倍。酵母菌的形态通常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等多种。酵母菌的无性繁殖主要有芽殖，其次是裂殖与产生掷孢子和厚垣孢子；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。酵母菌的母细胞在一系列的芽殖后，如果长大的子细胞与母细胞并不分离，就会形成藕节状的假菌丝。

本实验用生理盐水（或革兰氏染色用碘液）制作水浸片来观察酵母菌的形态和出芽繁殖方式，并用美蓝水浸片鉴别酵母细胞的死活。美蓝是一种无毒的弱氧化剂染料，其氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞为无色，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，故可用美蓝鉴别细胞的死活。但应注意美蓝的浓度不易过高（一般以0.05%浓度为宜），染色时间不宜过长，否则对细胞活性有影响。

在酵母菌中能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。在生产上往往以子囊孢子生成的快慢鉴别野生酵母与生产酵母，一般野生酵母生成子囊孢子的速度较快。双倍体酵母细胞经多次芽殖或裂殖后，在适宜条件下能形成子囊孢子。酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，故对不同种属的酵母菌要选择适合形成子囊孢子的培养基。将啤酒酵母从营养丰富的培养基上移植到产孢子培养基——麦氏（McCLary）培养基（醋酸钠培养基）上，于适温下培养，即可诱导子囊孢子的形成。

2.实验材料

（1）菌种 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、假丝酵母（Candida spp.）28℃培养24～48h的麦芽汁（或PDA培养基）斜面试管培养物。

（2）培养基 麦芽汁琼脂斜面试管，马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板，玉米粉蔗糖琼脂平板，醋酸钠琼脂斜面试管或平板（麦氏培养基）。

（3）溶液、染色剂 8.5‰生理盐水、革兰氏碘液、0.05%和0.1%美蓝染色液（以pH6.0的0.02mol/L磷酸盐缓冲液配制）、5%孔雀绿染色液、95%乙醇、0.5%沙黄染色液、0.04%或0.1%中性红染色液（水溶）。

（4）仪器或其他用具 接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、镊子、显微镜、恒温培养箱。

3.实验步骤

（1）啤酒酵母的形态观察

①生理盐水浸片法：在载玻片中央加1滴无菌生理盐水（不宜用无菌水制作水浸片，否则细胞易破裂），然后按无菌操作用接种环取少量啤酒酵母菌苔与生理盐水混匀，使其分散成云雾状薄层，另取一清洁盖玻片，将一边与菌液接触，以45°角缓慢覆盖菌液（避免留有气泡而影响观察）。先用低倍镜观察，再用高倍镜观察酵母菌的形态、大小及出芽情况。

②水-碘液浸片法：在载玻片中央加1小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水-碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。

（2）假丝酵母的形态观察 用划线法将假丝酵母接种在PDA琼脂或玉米粉琼脂培养基平板上，在划线部位加无菌盖玻片，于25～28℃培养3天，用无菌镊子取下盖玻片放于洁净载玻片上。先用低倍镜观察，再用高倍镜观察呈树枝状分枝的假菌丝形态，或打开平皿盖，在显微镜下直接观察。假丝酵母刚形成的假菌丝和出芽繁殖形成的芽体不易区别，前者由细胞伸长成圆筒形，后者从其末端部或出芽连接部出芽，当生成丝状时则较易区别。

（3）酵母菌死活细胞的鉴别 在载玻片中央加1滴0.1%美蓝染色液，然后按无菌操作以接种环挑取少量啤酒酵母菌苔与染色液混匀，染色2～3min。另取一清洁盖玻片，将一边与菌液接触，以45°角缓慢覆盖菌液。将制片先用低倍镜，再用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，区分其母细胞与芽体，区分死细胞（蓝色）、活细胞（不着色）和老龄细胞（淡蓝色）。染色约30min后再次进行观察。用0.05%美蓝染液重复上述操作。在一个视野里计数死细胞和活细胞，共计数5～6个视野。酵母菌死亡率一般用百分数来表示，按下列公式来计算：

（4）酵母菌子囊孢子的观察

①菌种活化与子囊孢子的培养：将啤酒酵母移种至新鲜麦芽汁琼脂斜面上，25～28℃培养24h，如此连续移种2～3次，每次培养24h。将经活化的菌种划线转接到醋酸钠琼脂斜面或平板上，25～28℃培养约1周。

②染色与观察：挑取少许产孢子菌苔于载玻片的水滴中，经涂片、干燥、热固定后，加数滴孔雀绿，染色1min后水洗，加95%乙醇脱色30s后水洗，最后用0.5%沙黄复染30s后水洗，用吸水滤纸吸干。油镜观察子囊孢子呈绿色，菌体和子囊呈粉红色。注意观察子囊孢子的数目、形状和子囊的形成率。

亦可不经染色直接制作水浸片，用高倍镜观察。水浸片中的酵母菌的子囊为圆形大细胞，内有2～4个圆形的小细胞即为子囊孢子。

③计算子囊形成的百分率：计数时随机取3个视野，分别计数产子囊孢子的子囊数和不产孢子的细胞，按下列公式计算：

④酵母菌液泡的活体观察：于洁净载玻片中央加一滴中性红染色液，取少量啤酒酵母斜面菌苔与染色液混匀，染色5min，加盖玻片，在高倍镜下观察，细胞无色，液泡呈红色。中性红是液泡的活体染色剂，在细胞处于生活状态时，液泡被染成红色，细胞质及核不着色。若细胞死亡，液泡染色消失，细胞质及核呈现弥散性红色。

二、霉菌标本片的制作

1.基本原理

霉菌是由复杂的菌丝体组成。它分为基内菌丝、气生菌丝和繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌的繁殖菌丝及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。观察霉菌的形态常用的有下列三种方法：

（1）乳酸石炭酸棉蓝浸片法 将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片。由于霉菌菌丝较粗大（约为3～10μm），置于水中观察时，菌丝容易收缩变形，故常用乳酸石炭酸棉蓝染色液制片使细胞不会变形，染液的蓝色能增强反差，并具有防腐、防干燥、防止孢子飞散作用，能保持较长时间，必要时还可用光学树胶封固，制成永久标本长期保存。但用接种针（或小镊子）挑取菌丝体时，菌体各部分结构在制片时易被破坏，不利于观察其完整形态。

（2）小室载玻片培养法 用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置显微镜下观察。这种方法可以保持霉菌自然生长状态，便于观察到霉菌完整的营养和气生菌丝体的特化形态，例如曲霉的足细胞、顶囊，青霉的分生孢子穗、根霉的匍匐枝、假根等。此外，也便于观察不同发育时期的培养物。

（3）玻璃纸培养法 此种方法用于观察不同生长阶段霉菌的形态，亦可获得良好效果。

2.乳酸石炭酸棉蓝浸片法(www.xing528.com)

（1）菌种 可以用有多种霉菌的染色镜检，包括：根霉（Rhizopus spp.）培养2～5d的PDA斜面和平板培养物；毛霉（Mucor spp.）培养2～5d的PDA斜面和平板培养物；曲霉（Aspergillus spp.）培养2～5d的PDA斜面和平板培养物；青霉（Penicillium spp.）培养2～5d的PDA斜面和平板培养物。

（2）培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）。

（3）溶液、染色剂 乳酸石炭酸棉蓝染色液：将石炭酸加在水中加热溶化后，加入甘油和乳酸，最后加棉蓝溶解即可。50%乙醇、20%甘油。

（4）仪器或其他用具 接种环、接种针或解剖针、镊子、解剖刀、酒精灯、载玻片、盖玻片、U形玻璃棒、平皿、无菌细口滴管、显微镜、恒温培养箱等。

（5）实验步骤 在载玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针（或小镊子）从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再置于载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片（注意勿压入气泡和移动盖玻片，以免影响观察），置于低倍镜和高倍镜下观察四类霉菌内容如下：

根霉：用低倍镜观察孢子囊梗、囊轴等，用高倍镜观察孢子囊孢子的形状、大小。将根霉斜面培养物置于显微镜载物台上，用低倍镜观察根霉的孢子囊柄、孢子囊、假根和匍匐枝。

毛霉：用低倍镜观察孢子囊梗、囊轴等，用高倍镜观察孢子囊孢子的形状、大小。将毛霉斜面培养物置于显微镜载物台上，用低倍镜观察毛霉的孢子囊梗粗细、孢子囊大小、形状、色泽等。

曲霉：在高倍镜下观察菌丝有无隔膜，分生孢子着生位置，辨认分生孢子梗、顶囊、小梗和分生孢子。

青霉：在高倍镜下观察菌丝有无隔膜，分生孢子梗、副枝、小梗和分生孢子的形状等。

3.小室载玻片培养法

（1）培养小室的灭菌 将略小于平皿底部的圆滤纸片1张、U形玻璃棒、载玻片和两块盖玻片等，如图2-8所示，放入平皿内，盖上平皿盖，包扎后于121℃灭菌30min，置60℃烘箱中烘干备用。

图2-8 小室载玻片培养法示意图

1—平皿 2—U形玻璃棒 3—盖玻片 4—培养物 5—载玻片 6—保湿用滤纸

（2）琼脂块的制作 取已灭菌的PDA琼脂培养基6～7mL注入另一灭菌平皿中，使之凝固成薄层。用解剖刀切成0.5～1.0cm²的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上（每片放两块）。制作过程应注意无菌操作。

（3）接种和培养 用接种针挑取很少量的青霉或曲霉孢子接种于培养基四周，用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上，并轻压使之与载玻片间留有极小缝隙，但不能紧贴载玻片，否则不透气。先在平皿的滤纸上加3～5mL灭菌的20%甘油（用于保持平皿内的湿度），盖上皿盖，皿盖上注明菌名、组别和接种日期，置28～30℃培养3～5d。

（4）镜检 培养至1～2d后逐日观察霉菌生长发育情况。用低倍镜和高倍镜观察小室载玻片培养的曲霉分生孢子头和青霉的帚状枝形态，菌丝有无隔膜等情况。

工作任务实施

某微生物检验实验室分离出一批未知菌，请你对其进行染色及镜检。

1.小组讨论，制定检测工作方案，确定人员分工，并填写以下工作文件

2.完成实验准备工作

（1）药品和试剂的准备

（2）实验设备的准备

（3）实验用具的准备

3.染色及镜检过程

严格规范操作，保证结果的可靠性。

4.结果分析及检测报告的撰写

5.实验后整理