一、细菌简单染色法
1.基本原理
细菌形体微小，无色而透明，折光率低，在普通光学显微镜下不易识别，因此必须借助染色方法，将其折光率增大而与背景形成明显的色差，再经显微镜的放大作用，才能更清楚地观察到其形态和结构。
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，故碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。简单染色的常用染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
2.实验材料
（1）菌种 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）12～18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌（Escherichia coli）约24h营养琼脂斜面培养物。
（2）染色剂 吕氏碱性美蓝（亚甲基蓝）染液、草酸铵结晶紫染液、齐氏石炭酸复红染色液。
（3）仪器或其他用具 显微镜、酒精灯、载玻片、擦镜纸、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、接种环、0.85%生理盐水、吸水滤纸、纱布、火柴、记号笔、玻片夹、镊子等。
3.实验流程
玻片准备→涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检。
（1）玻片准备 取保存于95%酒精中的洁净而无油渍的载玻片，用洁净纱布擦去酒精。如载玻片有油渍可滴2～3滴95%酒精或1～2滴冰醋酸，用纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上烤几次，再用纱布反复擦拭干净。
待冷却后，用记号笔于玻片右侧注明菌名或菌号。如有多个样品同时制备涂片时，只要染色方法相同，亦可在同一张载玻片上有秩序地排好，用记号笔在载玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种菌种，如此一张载玻片可同时完成多种菌的染色任务。
（2）涂片 所用材料不同，涂片方法各异：
①固体材料：斜面菌苔、平板菌落等培养物。
先将0.85%生理盐水滴一小滴（或用灭菌接种环挑取1～2环）于玻片中央，而后用接种环以无菌操作，分别从实验菌种培养物的斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜，如图2-5和图2-6所示。
涂片无菌操作要点：a.试管或三角瓶在开塞后及回塞前，其口部应在火焰上烧灼灭菌，除去可能附着于管口或瓶口的微生物。开塞后的管口或瓶口应靠近酒精灯火焰，并尽量平置，以防直立时空气中尘埃落入，造成污染。b.接种环在每次使用前后均应在火焰上彻底烧灼灭菌；挑取菌苔前，必须待其冷却后进行。
②液体材料：液体培养基培养物、菌悬液等培养物。
可直接用灭菌接种环取2～3环菌液于载玻片中央，均匀涂抹成适当大小的薄膜，如图2-5所示。
③组织材料：肉类及其制品等材料。
应先以镊子夹持局部，然后以灭菌剪刀切一小块，用新鲜切面于载片上压印或涂成薄膜。
（3）干燥 室温自然干燥。有时为加速干燥，也可将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥，但切勿紧靠火焰。
（4）固定
①固定有两个目的：一是杀死菌体细胞，使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使菌体牢固附着于载玻片上，以免水洗时被冲掉；二是使菌体蛋白变性，改变对染色剂的通透性，增加其对染料的亲和力，使其更易着色。
图2-5 涂片无菌操作过程
1—灼烧接种环 2—拔去棉塞 3—烘烤试管口 4—挑取少量菌体5—再烘烤试管口 6—将棉塞塞好 7—做涂片 8—烧去残留菌体
图2-6 涂片、干燥和热固定
②固定的方法：所用材料不同，固定的方法各异。
a.加热固定：对于斜面菌苔、平板菌落、液体培养物等涂片以火焰加热固定。将干燥好的涂片的涂面朝上，以钟摆速度通过火焰3～4次，略微加热固定。
b.化学固定：对于血液、组织脏器等涂片以甲醇固定。将已干燥的涂片浸入甲醇中，2～3min后取出，甲醇自然挥发。
（5）染色 将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。吕氏碱性美蓝染色2～3min；石炭酸复红（或草酸铵结晶紫）染色约1～2min。
（6）水洗 倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。
（7）干燥 自然干燥，也可用吸水滤纸吸干。
（8）镜检 正确使用显微镜进行镜检。
4.注意事项
（1）涂片时载玻片要洁净无油迹，否则菌液涂不开；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。以淡淡的乳白色为宜，涂布面积直径约1cm。
（2）加热固定时，温度不能过高，以玻片不烫手背为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。
（3）水洗时，不要直接冲洗涂抹面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。
二、细菌革兰氏染色法
1.基本原理
革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。根据细菌细胞壁的结构和化学组成的不同，经革兰氏染色后，呈现不同的染色反应，可将所有细菌区分为两大类，即革兰氏阳性菌（用G+表示）和革兰氏阴性菌（用G-表示）。当细菌用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。染色关键在于脱色剂的脱色作用。当用乙醇（或丙酮）处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G+细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量较低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量较高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
2.实验材料
（1）菌种 大肠杆菌或沙门氏菌约24h营养琼脂斜面培养物，枯草芽孢杆菌（或蜡样芽孢杆菌）约18～20h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物。
（2）染色剂 草酸铵结晶紫染色液、鲁格尔氏碘液、95%乙醇、0.5%番红（沙黄）染色液。
（3）仪器或其他用具 同“简单染色法”。
3.实验流程
制片→涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫初染（1min）→水洗→碘液媒染（1min）→水洗→95%乙醇脱色（30s）→水洗→沙黄复染（1min）→水洗→干燥→镜检。
（1）制片、干燥及固定 取菌种培养物按简单染色法中的常规涂片、干燥、固定进行制片。注意要用活跃生长期的幼龄培养物做革兰氏染色。
（2）初染 在涂片菌膜处滴加草酸铵结晶紫适量（以刚好将菌膜覆盖为宜），染色1～2min，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色。
（3）媒染 滴加碘液于涂片上，作用1min，水洗。
（4）脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，滴加95%酒精于涂片上，轻轻摆动玻片，直至乙醇脱色刚好不出现紫色为止，一般30s（如牛乳培养物用60s）后立即水洗，终止脱色。
（5）复染 滴加番红（沙黄）复染液于涂片上，作用1min，水洗。
（6）干燥 自然干燥，也可用吸水滤纸吸干。
（7）镜检 正确使用显微镜进行镜检。油镜检查。G+菌呈蓝紫色，G-菌呈红色。
4.注意事项
（1）涂片不宜过厚，勿使细菌密集重叠，影响脱色效果，否则脱色不完全造成假阳性。镜检时应以视野内分散细胞的染色反应为标准。
（2）火焰固定不宜过热，以玻片不烫手为宜，否则菌体细胞变形。
（3）滴加染色液与酒精时一定要覆盖整个菌膜，否则部分菌膜未受处理，亦可造成假象。
（4）乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。如脱色过度，则G+菌被误染成G-菌；而脱色不足，G-菌被误染成G+菌。在染色方法正确无误的前提下，如菌龄过长，死亡或细胞壁受损伤的G+菌也会呈阴性反应，故革兰氏染色要用活跃生长期的幼龄培养物。
（5）染色过程的时间控制，应根据季节、气温调整。一般冬季时间可稍长些，夏季稍短些。
（6）对待检菌进行革兰氏染色时，最好同时用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为阴性菌和阳性菌的对照。
三、细菌芽孢染色
1.基本原理
芽孢又称内生孢子（Endospore），是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体。通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的着生位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的重要依据之一。
由于芽孢壁厚、透性低、比营养细胞不易着色与脱色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圆形或椭圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。其基本原理是：先采用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使菌体和芽孢均着色，再用水冲洗，则菌体已脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱。当用另一种对比度大的复染剂沙黄或美蓝染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。
芽孢染色法有常规的和改良的Schaeffer—Fulton氏染色法。改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规法优越，可优先选用。(www.xing528.com)
2.实验材料
（1）菌种 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或蜡样芽孢杆菌（B.cereus） 20h营养琼脂斜面培养物；球形芽孢杆菌（B.sphaericus）24h营养琼脂斜面培养物。
（2）染色剂 5%孔雀绿水溶液，0.5%番红（沙黄）染色液。
（3）仪器或其他用具 小试管、滴管、烧杯、试管架、木夹子，其他用具同“简单染色法”。
3.常规的Schaeffer—Fulton氏染色法
（1）制片 按常规涂片、干燥、固定。
（2）染色 加孔雀绿染液3～5滴于涂片上，用木夹夹住载玻片一端，在酒精灯上微火加热至染料冒蒸汽并开始计时，维持5min。
（3）水洗 待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，直至流出的水无色为止。
（4）复染 用番红染液复染1～2min。
（5）水洗 用缓流水洗后，滤纸吸干。
（6）镜检 油镜观察，芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体呈红色。
4.改良的Schaeffer—Fulton氏染色法
（1）制备菌悬液 加1～2滴生理盐水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3环菌苔于试管中，搅拌均匀，制成浓稠的菌悬液。
（2）染色 加孔雀绿染液2～3滴于小试管中，并使其与菌液混合均匀，然后将试管置于沸水浴的烧杯中，加热染色15～20min。
（3）涂片、固定 用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净载玻片上，涂成薄膜，晾干，然后将涂片通过火焰3次温热固定。
（4）脱色 水洗，直至流出的水无绿色为止。
（5）复染 用番红染色液染色2～3min，倾去染液并用滤纸吸干残液（不用水洗）。
（6）镜检 油镜观察，芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体呈红色。
四、细菌荚膜染色法
1.基本原理
荚膜是包围在细菌细胞壁外的一层黏液性胶状物质，其成分为多糖、多肽或糖蛋白。由于荚膜与染料的亲和力低、不易着色，而且溶于水，易被水洗除去，故一般采用衬托染色法（又称负染色法、背景染色法），使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成一透明圈。由于荚膜含水量高，不宜用热固定，而采用甲醇进行化学固定，以免荚膜变形。以下介绍3种荚膜染色法：湿墨水法、干墨水法、Anthony氏法，其中湿墨水法较简便，并适用于各种有荚膜的细菌。
2.实验材料
（1）菌种 褐色球形固氮菌（Azotobacter chroococcus）约2d无氮培养基琼脂斜面培养物，胶质芽孢杆菌（B.mucilaginosus）约2d无氮培养基琼脂斜面培养物。
（2）染色剂 墨汁染色液（或黑色素水溶液），1%甲基紫水溶液，1%结晶紫水溶液，6%葡萄糖水溶液，20%硫酸铜水溶液，甲醇。
（3）仪器或其他用具 载玻片、盖玻片、吸水滤纸、显微镜等。
3.湿墨水法
（1）制菌液 加1滴墨汁染色液于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其混合均匀。
（2）加盖玻片 将一洁净盖玻片盖于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压以吸去多余的混合液。
（3）镜检 用低倍镜和高倍镜观察，若用相差显微镜观察，效果更好。背景灰色，菌体较暗，在菌体周围呈现明亮的透明圈即为荚膜。
4.干墨水法
（1）制菌液 加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片的一端，挑取少量菌体与其混合，再加1环墨汁染色液，充分混匀。
（2）涂片 另取一端边缘光滑的载玻片作推片，将推片的一边与菌液接触，然后稍向后拉，轻轻左右移动，使菌液沿玻片接触处散开，而后以30°角迅速将菌液推向玻片另一端，使菌液铺成薄层，如图2-7所示。
图2-7 荚膜干墨水染色的涂片方法
（3）干燥、固定 空气中自然干燥后，用甲醇浸没涂片固定1min，倾去甲醇。
（4）干燥、染色 在酒精灯上方火焰较高处用文火干燥，勿使玻片发热。而后用甲基紫染色1～2min。
（5）水洗 用自来水轻轻冲洗，自然干燥。
（6）镜检 用低倍和高倍镜观察。背景灰色，菌体紫色，菌体周围的清晰透明圈为荚膜。
5.Anthony氏法
（1）制片 按常规涂片（多挑些菌体与水混合）、自然干燥、甲醇固定（勿加热干燥固定）。
（2）染色 用1%的结晶紫水溶液染色2min。
（3）脱色 以20%的硫酸铜水溶液洗去结晶紫（不可用水冲洗），脱色要适度（冲洗2遍）。用吸水滤纸吸干残液，并立即加1～2滴香柏油于涂片处，以防止硫酸铜结晶的形成。
（4）镜检 用油镜观察。背景蓝紫，菌体呈深紫色，荚膜呈淡紫色。
五、细菌鞭毛染色法
1.基本原理
鞭毛是细菌的运动器官，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数目是鉴定细菌的重要依据之一。细菌的鞭毛很纤细，其直径通常为0.01～0.02μm，于普通光学显微镜下难以见到，而只能用电子显微镜观察。如用光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。
其基本原理是：在染色前先采用不稳定的胶体溶液作为媒染剂处理，使之沉积于鞭毛上，加粗鞭毛的直径，然后再进行染色。鞭毛染色方法很多，本方法介绍硝酸银染色法和改良的Leifson氏染色法。硝酸银染色法较易掌握，但染色剂保存期较短。
良好的培养物是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用已形成芽孢或衰亡期培养物作鞭毛染色的菌种材料，因为老龄细菌鞭毛容易脱落。
2.实验材料
（1）菌种
①枯草芽孢杆菌或普通变形杆菌营养琼脂斜面培养物（斜面较湿润、下部要有少量的冷凝水，28～32℃连续移种2～3次，每次培养12～18h），取斜面和冷凝水交接处培养物作染色观察材料。
②枯草芽孢杆菌或普通变形杆菌营养琼脂平板培养物（将新鲜斜面菌种点种于含0.8%～1.0%的营养琼脂平板中央，28～32℃培养18～30h，使菌种扩散生长），取菌落边缘的菌苔作染色观察材料。
（2）染色剂 硝酸银鞭毛染色液（A液、B液），利夫森（Leifson）氏鞭毛染色液。
（3）仪器或其他用具 1～2mL无菌生理盐水（0.85%）试管，其他用具同“简单染色法”。
3.硝酸银染色法
（1）载玻片的清洗 为了使菌液流过载玻片时能迅速展开，保持细菌的自然形态，应选用洁净、光滑无划痕、无油迹的载玻片（水滴在玻片上能均匀散开）。清洗方法：将载玻片置于洗涤灵水溶液中煮沸10min，自来水冲洗，再用蒸馏水洗净，沥干水后置95%乙醇中脱水、脱油备用。使用时在火焰上烧去酒精。
（2）菌液的制备 取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1～2mL无菌生理盐水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片。也可用培养物直接制片，但效果往往不如先制备菌液。
（3）制片 取一滴菌液于载玻片的一端，将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用吸水滤纸吸去玻片下端多余菌液，而后放平，自然干燥。干后应尽快染色，不宜放置时间过长。
（4）染色 滴加硝酸银染色A液，染色3～5min，用蒸馏水充分洗去A液。用B液冲去残水后，再滴加B液覆盖涂片，用微火加热至出现水蒸气，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，自然干燥。配制合格的染色剂（尤其是B液）、待充分洗去A液后再加B液以及掌握好B液的染色时间均是鞭毛染色成败的重要环节。
（5）镜检 用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色，通常呈波浪形。
4.改良的Leifson氏染色法
（1）载玻片的清洗、菌液的制备 同“硝酸银染色法”。
（2）制片 用记号笔在载玻片反面将玻片分成3～4个等分区，在每一小区的一端放一小滴菌液。将玻片倾斜，让菌液流到小区的另一端，用滤纸吸去多余的菌液。自然干燥。
（3）染色 加Leifson氏染色液覆盖第一区的涂面，隔数分钟后，加染液于第二区涂面，如此继续染第三、四区。间隔时间自行议定，其目的是为了确定最佳染色时间。在染色过程中仔细观察，当整个玻片都出现铁锈色沉淀、染料表面现出金属光泽膜时，即直接用水轻轻冲洗（不要先倾去染料再冲洗，否则背景不清）。染色时间大约10min。自然干燥。
（4）镜检 按顺序用油镜观察，常有部分涂片区的菌体染出鞭毛，菌体和鞭毛均呈红色。
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
